Ⅱ型胶原蛋白抗体免疫组化试剂盒样本要求及实验操作步骤

  样本要求：新鲜活检样本组织，中性福尔马林或多聚甲醛，固定时间 12-48h，参照病理技术规范要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块，蜡块在常温条件下保存有效期有 5 年。组织切片厚度为 3-5μm 并黏

  附在防脱玻片上，轻拍切片架并用吸水纸吸干组织切片中的水滴，再放入 56-60℃恒温箱中烘烤 2h 后，从恒温箱中移出玻片放在温室下冷却。如果切片在室温下(15-28℃)保存，为了良好的重现组织中的抗原分布情况，请于切片制作后 7 天内完成检测。

  Ⅱ型胶原蛋白抗体免疫组化试剂盒

  实验操作步骤(以石蜡切片为例)

  仪器、设备：

  移液枪、免疫组化笔、水浴锅、计时器、孵育湿盒、切片架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。

  操作步骤

  1.脱蜡水化。将石蜡切片置于新鲜二甲苯脱中浸泡 15 分钟，重复三次。去除多余的液体后，依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡 5 分钟，蒸馏水(或自来水)冲洗 5 分钟。用 PBS 缓冲液(试剂 1，将干粉溶解于 2L 去离子水中)冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  2.抗原修复。将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上，加适量修复液 1× 柠檬酸钠抗原修复液(试剂 2，将 100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成 1×柠檬酸钠抗原修复液)，液面要浸过切片组织一定高度，将修复盒置于沸水中煮沸修复 15 分钟后取出玻片，自然凉至室温。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  注意：抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复液的量约为 800mL/1 架。

  3.阻断内源性过氧化物酶。用吸水纸擦干玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加 50μL 内源性过氧化物酶阻断剂(试剂 3)到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育 30 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  4.血清封闭。用吸水纸擦干玻片，滴加 50μL 正常山羊血清工作液(试剂 5)，37℃封闭 20 分钟，以减少非

  特异性染色。

  5.一抗孵育。用抗体稀释液(试剂 4)将一抗原液稀释成工作液，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，滴加适量抗体工作液，置于湿盒 4℃孵育过夜或 37℃孵育 1h-2h。

  6.复温。4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育 15min 复温(抗体孵育为 4℃过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗)。用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  7.二抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 生物素标记的羊抗兔 IgG(试剂 6)，37℃孵育 20 分钟，用 PBS

  缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  8.三抗孵育。吸水纸擦干切片后滴加 50μL 辣根酶标记的链酶卵白素孵育(试剂 7)，37℃孵育 20 分钟，用 PBS 缓冲液冲洗切片 5 分钟，重复三次。

  9. 显色。甩去 PBS 缓冲液，吸水纸擦干切片; 每张切片滴加新鲜配制的 DAB 工作液 50 μL

  (试剂 8：试剂 9：试剂 1=1:1:18 比例配置)，孵育 3-5min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深;显色后用自来水冲洗切片终止显色。

  10.复染。滴加适量苏木素染液(试剂 10)复染，孵育 1-5 分钟，自来水冲洗 5 分钟，滴加盐酸酒精分化液分化 30 秒，自来水冲洗。

  11.脱水封片。将玻片依次置于 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，各浸泡 5 分钟， 再将玻片放入二甲苯中浸泡 15 分钟，重复三次。玻片取出来稍晾干，用中性树胶封片。

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