正确规范的ELISA测定操作方法

  一、临床标本的收集和保存

  用于ELISA测定的临床标本zui为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。现在临床上运用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要留心收集时间甚或体位有可能会对测定作用发作影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性办法开释，因此，在测定此类激素时，有必要在接近相连的时间距离内采用数份血样本，以其中心值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的zui适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：

  (1)要留心避免出现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为符号酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很简单在温育进程中吸附于固相，然后与后边参与的HRP底物反应显色。

  (2)样本的收集及血清分别中要留心尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白发作分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定办法发作非特异性搅扰。

  (3)血清标本如是以无菌操作分别，则能够在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则主张冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。

  (4)冰冻保存的血清标本须留心避免因停电等形成的重复冻融。标本的重复冻融所发作的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发作损坏作用，然后引起假阴性作用。此外，冻融标本的混匀亦应留心，不要进行剧烈振荡，重复倒置混匀即可。

  (5)标本在保存中如出现细菌污染所形成的的混浊或絮状物时，应离心堆积后取上清检测。

  二、试剂准备

  在临床实验室，对试剂准备一般不太留心，一般的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后边温育时间不可的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备zui为要害的是，在实验开端前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在运用前与室温平衡。这样做的目的，首要是为了在后边的温育反应进程中，能使反应微孔内的温度能较快地抵达所要求的高度，以满足测定要求。其次，现在的产品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室运用时对所供给的浓缩液稀释制造，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前暂时制造。

  三、加血清样本及反应试剂 本

  在现在的ELISA产品试剂盒中，血清样本的参与几乎是仅有的要运用微量加样器参与样本的进程。运用微量加样器加样有必要留心的要害点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅起和发作气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅起会对附近孔发作污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的参与在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要留心滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很简单出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，然后引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的差错所形成的。

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