七色多重荧光染色试剂盒(六标七色)操作步骤?

  详细操作步骤

  1、样本准备：

  1)石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸馏水洗。

  2)冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

  3)细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min，PBS洗5min重复3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

  2、抗原修复：组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法)。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤)。

  3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

  4、非特异性靶点封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用抗体稀释液(或者其他封闭液 3%BSA 或者山羊血清)均匀覆盖组织，室温封闭30min。额外说明：抗体稀释液内含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期四度保存(在常温下也可以保存一个月之久)

  5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h(湿盒内加少量水防止抗体蒸发);

  6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。额外说明：本试剂盒内自带的hrp山羊抗兔/鼠通用二抗为即用型，具有超高灵敏度，随时可用，无需配置。

  7、TSA荧光染料反应液反应：浓缩型荧光染料与TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均匀，切片滴加配好的TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应1-15min(佳时间5min-10min)，PBS洗三次(预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步)。

  8、抗体洗脱：石蜡切片置于抗原修复液中95度水浴25-40min(根据不同抗体亲和力 灵活调整时间)或者滴加适量37度预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液(冰冻切片爬片骨组织建议用)覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37度放置5-20分钟，弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟(石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰切切片需用抗体洗脱液进行洗脱)

  9、 重复3-8步骤(换用另外一种TYR-XXXPLus 荧光染料)---第二轮标记

  10、重复3-8步骤(换用另外一种TYR-XXXPLus 荧光染料)---第三轮标记

  11、重复3-8步骤(换用另外一种TYR-XXXPLus 荧光染料)---第四轮标记

  12、重复3-8步骤(换用另外一种TYR-XXXPLus 荧光染料)---第五轮标记

  13、重复3-7步骤(换用另外一种TYR-XXXPLus 荧光染料)---第六轮标记

  14、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI即用型染液，避光室温孵育5min-20min。

  15、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片(我司有相应产品)。

  16、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

  染料激发波长发射波长

  DAPI 蓝色350420

  TYR-480Plus450480

  TYR-520Plus绿色490520

  TYR-570Plus红色550570

  TYR-620Plus590620

  TYR-690Plus630690

  TYR-780Plus750780

  文章引用试剂盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Seven color mIHC Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

  七色多重荧光染色试剂盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦东新区。是一家专门从事生物技术相关产品，励志研发和销售的综合性生物公司，产品远销多个国家和地区，我们将一如既往地秉承“一切为了满足客户的需求"的经营宗旨;牢固树立“以客户需求为准则、以市场需求为导向，不断开发高质量的新产品，提供客户满意的综合服务质量"的方针。