古朵资讯| ELISA实验中标曲和样本的显色问题

  ELISA实验是我们科研实验中经常使用的实验方法，看似简单其实有许多需要我们去注意的，今天古朵生物技术小编就和大家介绍下实验中常见的标曲和样本的显色问题。

  一、标曲不显色或显色很弱，样本显色。

  溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定好。

  二、标曲和样本均不显色。

  在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

  如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。所以在实验过程中，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

  三、标曲显色，样本不显色。

  到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

  对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也加可信。

  四、标曲和样本都显色，但复孔的CV大。

  这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。个人的操作可以在空白板上练习移液动作，或者在几十个离心管中加入相同体积的水，通过电子天平称量，检验移液的度。同时还需练习加快加样速度，减少从个样本到后一个样本加样时间过长导致的差异。

  ELISA实验中有关标曲和样本的显色问题主要就是以上4种，当然还会存在其他的问题，在这里就不一一介绍了，大家在操作过程中要细心谨慎，防止出现以上的问题。

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