ELISA样本测值低的原因

  ELISA实验中，实验者经常会遇到样本测值低的问题，样本类型包括血清、 血浆、组织匀浆、细胞裂解液等。假设实验操作完全正确，标准曲线良好，这种情况样本测值低可从两方面进行分析：一是样本本身含量可被检测，但由于实验操作等原因导致样本测值不在试剂盒检测范围内;二是分析物在样品中本身浓度偏低。下面将从这两个方面来进行分析导致样本测值低的因素以及对应的解决方案。

  1、样本本身含量可以被检测，有哪些原因导致测值低呢?

  (1)试剂盒的保存

  试剂盒要按照规定的方法保存，实验者在购买试剂盒时请务必留心试剂盒不同组分的保存方法。

  (2)样本上样前的准备

  这个过程包括样本的制备、保存以及是否有经历过反复冻融。样本的制备要根据样本类型采用不同的方法，血清、血浆与细胞裂解液的制备方法均不同。保存，包括保存温度以及保存时间。一般推荐样本制备后进行分装后储存在-20度或-80度，储存时间不宜过久，因为长时间的储存有可能导致目标蛋白的降解，致使检测结果不理想。后注意不要反复冻融，蛋白样本反复冻融会导致降解发生。

  (3)稀释方案

  样本的稀释对于实验的成功至关重要，稀释过度以及稀释不足均有可能导致样本的测值低。

  稀释过度：一般情况下客户都会根据文献测值，以及检测范围估计一个稀释倍数，一般的试剂盒在出厂之前也会做大量检测，对于常规样本如血清血浆，会根据实验室样本测值情况推荐一个稀释倍数。但实验者如果直接按照估计或推测的稀释倍数进行稀释检测后，发现样本OD非常低。这是由于文献作者用的样本，厂家实验用的样本与实验者的样本会存在一定的差异，这些测值有一定的参考意义，但如果照搬，可能会导致实验失败。所以建议实验 者在正式试验前是先做预实验确定样本的有效性以及佳稀释倍数。

  稀释倍数不够：钩状效应，ELISA实验中发生钩状效应主要是当抗原与抗体比例不合适而导致假阴性的现象，抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含量很高，而没有进行正确的稀释，就有可能会导致假阴性反应。解决方案依旧同稀释过度的解决方案一样，在正式实验之前做预实验。

  2、分析物在样品中本身浓度偏低

  很多时候，客户操作没有问题，标准曲线良好，但检测多次样本依然不在检测范围。像细胞因子，如 IL-6 需在炎症刺激情况才会大量产生，一般非炎症样本测值会非常低。针对这种测值比较低的情况，一般建议根据文献选取适合的样本类型，同时可以选用高灵敏度的试剂盒。

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