叶绿素知识与叶绿素荧光测定的原理（下）

发布时间：2022-06-06浏览次数：1009返回列表

叶绿素知识与叶绿素荧光测定的原理（下）

将一片脱去淀粉的紫罗兰叶片放在阳光下数小时之后用碘试剂检测，可以发现只有叶片上绿色的区域变色而白色区域没有，也就是说只有绿色区域有淀粉存在。这显示了光合作用在缺乏叶绿素的情况下无法进行，叶绿素存在是光合作用的必要条件。

叶绿素 - 荧光现象和磷光现象
叶绿素的可见光波段的吸收光谱，在蓝光和红光处各有一显著的吸收峰。吸收峰的位置和消光值的大小随叶绿素种类不同而有所不同。叶绿素a大的吸收光的波长420-663nm，叶绿素b 的大吸收波长范围在460-645nm。当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。（手持式叶绿素测定仪）
叶绿素的酒精溶液在透射光下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。这个红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。这个现象就是荧光现象。其主要原理是由于叶绿素有两个不同的吸收峰。叶绿素吸收光的能力，如果把叶绿素的丙酮提取液放在光源与分光镜之间，可以看到光谱中有些波长的光被吸收了。因此，在光谱上就出现了黑线或暗带，这种光谱叫吸收光谱。叶绿素吸收光谱的强区域有两个：一个是在波长为640nm-660nm的红光部分，另一个在波长为430nm-450nm的蓝紫光部分。对其他光吸收较少，其中对绿光吸收少，由于叶绿素吸收绿光少，所以叶绿素的溶液呈绿色。叶绿素的丙酮提取液在透射光下是翠绿色的，而在反射光下是综红色的。叶绿素溶液的荧光可达吸收光的10%左右。而鲜叶的荧光程度较低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。
荧光效应在植物生理学中有广泛的应用。用这个效应可以研究植物的抗逆生理。因为在逆境下，植物的叶绿素会发生变换，研究其荧光，可以作为植物受逆境胁迫程度的指标。另外，还有一个磷光效应。就是当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到微弱红光，这就是磷光。（Chlorotech121A手持式叶绿素荧光测定仪）
叶绿素 - 生物合成与代谢
叶绿素a的生物合成途径，是由琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成δ-氨基乙酰丙酸，两个δ-氨基乙酰丙酸缩合成吡咯衍生物胆色素原，然后再由4个胆色素原聚合成一个卟啉环──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成叶绿素和亚铁血红素的共同前体，与亚铁结合就成亚铁血红素，与镁结合就成镁原卟啉。镁原卟啉再接受一个甲基，经环化后成为具有第Ⅴ环的原脱植醇基叶绿素，后者经光还原、酯化等步骤而形成叶绿素a。
叶绿素在活体内也和其他物质一样处于不断新状态。它被叶绿素酶分解，或经光氧化而漂白。深秋时许多树种叶片呈美丽的红色，就是因为这时叶绿素降解速度大于合成速度，含量下降，原来被叶绿素所掩盖的类胡萝卜素、花色素的颜色显示出来的缘故。
在植物衰老和储藏过程中，酶能引起叶绿素的分解破坏。这种酶促变化可分为直接作用和间接作用两类。直接以叶绿素为底物的只有叶绿素酶，催化叶绿素中植醇酯键水解而产生脱植醇叶绿素。脱镁叶绿素也是它的底物，产物是水溶性的脱镁脱植叶绿素，它是橄榄绿色的。叶绿素酶的适温度为60-82℃，100℃时完全失活。起间接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、过氧化物酶、果胶酯酶等。蛋白酶和酯酶通过分解叶绿素蛋白质复合体，使叶绿素失去保护而易遭到破坏。脂氧合酶和过氧化物酶可催化相应的底物氧化，其间产生的物质会引起叶绿素的氧化分解。果胶酯酶的作用是将果胶水解为果胶酸，从而提高了质子浓度，使叶绿素脱镁而被破坏。
在活体绿色植物中，叶绿素既可发挥光合作用，又不会发生光分解。但在加工储藏过程中，叶绿素经常会受到光和氧气作用，被光解为一系列小分子物质而褪色。光解产物是乳酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸以及少量丙氨酸。因此，正确选择包装材料和方法以及适当使用抗氧化剂，以防止光氧化褪色。
叶绿素提取的准备工作是在一个半暗的房间里，室温保持在25℃。提取步骤如下：
(1) 取1000克新鲜的绿叶，在韦氏搅切器中粉碎。
(2)将粉碎的1000克绿叶放进加有少量的碳酸钙的丙酮中(温度20℃)进行萃取，直到过滤、清洗后的叶子碎片为无色。
(3)将过滤后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后轻轻地旋转，同时加放蒸馏水直到分层为止。水层的大部分丙酮和水溶杂质被丢弃，只剩石油醚溶液。
(4)将石油醚溶液用蒸馏水再次净化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，后得到黄绿色悬浮液。
(5)用无水硫酸钠对悬浮液进行干燥，并将其渗入到75px厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉类胡萝卜素，使之只含有天然的叶绿素。
(6)含有天然叶绿素的蔗糖柱分两层，绿层有4-10mm的叶绿素b层，另一蓝层为2-6mm的叶绿素a层。
(7)将位于蓝层正中的部分(约占蓝层的一半) 放入醚中，对此悬浮液进行过滤、洗提，用蒸馏水清洗，用硫酸钠干燥，再用器皿进行过滤后，得到叶绿素a。
(8)将(6)中的绿层中间部分移出，迅速放入醚中过滤、洗提，制成叶绿素b醚溶液。

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