对于使用染料法的定量PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度（Tm值），但运用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出适合的反应条件。

不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的佳反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。

使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程，简化了摸索 PCR反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提率，又节省实验成本。

随着PCR技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，荧光定量PCR仪也不能幸免。从初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。

在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的性和准确性都要在实验中使用ROX（一种荧光染料）或专用的Reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要，不能单单只听宣传。

考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重PCR并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。