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PCR扩增仪选择的两大因素

发布时间:2017-06-22浏览次数:1608返回列表

导读:如今PCR扩增仪已经越来越完善和智能化,对于选择PCR扩增仪我们需要关注两个问题一个是温度的控制,再者就是人性化的设计,下面我们具体去聊一聊这两个影响因素。
一、温度控制 
对普通PCR仪来说,温度控制指标主要是指温度的准确性、均匀性、以及升降温速度,对梯度PCR仪来说,除了温度的准确性和均匀性、升降温速度以外,还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。
 温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性,它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题,对于PCR反应而言重要的莫过于温度控制的准确性,由于PCR是一个几何级数扩增的过程,扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果,不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度,对退火温度而言温控显的尤为重要,有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败,所谓差之毫厘,谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。
 温度的均匀性是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用同样的样品,同样的PCR反应程序,后的结果竟然差异非常明显,或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔,就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论,PCR仪的温度均匀性不好,特别是外周的样品孔情况差,很有可能影响实验结果--即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响为明显,所以后来才有Roche和Cobbett的离心式定量PCR的重大创新。
 温度控制除了度,还有一个厂家喜欢大力宣传的指标--升降温的速度。快的升降温速度,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,能提高PCR反应煌特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温快速的半导体。除了机械本身的原因,影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。
作为用户来说,当然愿意选择升降温速度快的,这就像汽车上好看的表面配置一样容易看到,而内在的稳定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必须注意到,仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事,因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。
 现在的PCR仪一般具有两种温控模式,即模块温控模式(Block-control)和反应管温控模式)(tube-control)。在模块温控模式下,机器根据探se器直接探se的温控模块(即承载样品的金属台)的温度进行控制,这种模式适用于长时间的静态孵育(如连接、酶切、去磷酸化等)。反应管温控模式实际上是一种模拟试管/PCR板的温控模式,根据探se器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来,试管温控为准确,因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。特别是PCR反应中的孵育过程一般都很短暂(30秒或短),如果采用只有模块温控模式的话,反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。而反应管控制的算法能自动补偿时间,而且适合各种类型的反应管,确保反应混俣物按照程序设定的时间维持预设温度。
有的PCR仪厂家推出了另一种温控方式;热敏电温控模式。该方法将一个热敏电插入一个专门的测量管中(管中装有矿物油),反应进行时,将该测量管插入温控模块的样品进行检测。他们认为通过此途径可以监测反应管内样品的实际温度,但这种方法未免有些华而不实;(1)测量管中矿物油的温度变化与实际反应样品的温度变化未必一致;(2)因为测量管必须占用一个样品孔,所以使用该温控方式时就无法使用96孔PCR板作实验。
 二、仪器的功能性和人性化设计 当然是越简单方便的设计符合用户的要求。
热盖--现在的PCR仪一般均配备热盖,热盖温度设为105℃,使样品管顶部的温度达到105℃左右,蒸发的反应液就不会产生凝集在管盖上而改变反应体积,这样用户就无需再向反应管内加石蜡油,直接减少后继反应的麻烦。如果是旋转加压的热盖就要特别小心,因为压力到达时没有明显的提示,用户需要根据经验将热盖旋到合适位置,不太容易掌握。如果过松,热盖没有充分接触反应管而影响结果;如果过紧,则会导致反应管变形,甚至可能造成热盖的机械故障。新的ESP技术是指热盖加热时不接触样品管,避免加热样品管导致非特异产物,等加热到设定温度后热盖下降,将样品管压入加热模块,下降时间和压力都由电子控制。
样品基座--PCR反应多在0.2或者0.5的管子中进行,多数PCR仪也配备了不同的可换样品槽适配不同的样品管。eppendorf有一个有趣的设计,一个槽内带有0.2和0.5两种不同样品孔,不需换基座就可以分别使用两种不同的反应管,或者96孔板,加原位适配器就可以变成原位PCR了。避免了换基座的麻烦。当然不同的反应管不可以同时使用的,因为高度不同,热盖不能作用。ABI的9700就可以换不同的样品槽,样品槽系列扩增到从0.5到标准96孔,到双384孔板,分别适合不同的需要,相当灵活。
软件--新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕,显示实时信息,,记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。程序储存方面,有人觉得储存程序的多少似乎意义不太大,但是对于实验人员多、PCR仪每天运作频繁的实验室来说,每个使用者储存自定义的PCR程序,确实能方便下一次的调用,会节约一些时间。