大家经常谈起荧光PCR分析参数设置与结果的关系、乙肝低值质控品浓度的选择及依据，质控品CV值的确定等问题。这些问题多是大家熟悉但并没有深究，在日常工作中多没有合理使用，今天和大家讨论如下，希望对实验室的质量提升有所帮助。
    基线起点和终点的选择
    基线（Baseline）是指在PCR扩增的初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即为基线。不同荧光PCR试剂盒由于其敏感性不同，基线起点和终点的设置也不同。对于性能的荧光PCR试剂盒，只需要确定基线的终点，即在早PCR扩增曲线起点前一个循环作为终点，起点在终点前间隔一个以上的循环选择即可，这样的分析结果是稳定的。由于PCR干扰物质的影响或试剂盒抗干扰性能的差异，有的试剂盒扩增曲线，在S型扩增前出现曲线下陷或曲线上扬的情况。这时需要对该样本曲线进行个性化分析，或对该样本重新检测。基线的选择常常与其它分析参数具有联动性，不同PCR扩增仪的基线确定也有不同。
    荧光阈值的选择
    荧光阈值应设在PCR指数扩增的起始，并高于阴性对照曲线。其数值选择与试剂盒的性能有关，对荧光强度较高的扩增曲线，阈值的设定不一定非要遵循固定的原则，基线确定后，阈值几乎可以随机选择或直接使用仪器默认的阈值；如果试剂盒的荧光扩增强度较弱，出现核酸含量较低的样本扩增曲线荧光值较低，这时阈值的选择对低值样本的定量结果影响较大（下图）。因此，针对试剂盒性能不同，实验室应建立自己的阈值范围，尽可能保证低值样本检测结果的稳定性。
    斜率
    试剂盒的标准曲线一般由4个间隔10倍或100倍梯度浓度的标准品拟合而成。标准品的浓度是由企业参考品或参考品定值溯源而来，标准品的理论检测值和实际检测值进行线性拟合，其理论斜率是3.32，但实际工作中，试剂盒的实际斜率经常出现高于3.32或低于3.32的情况。
    主要有以下两个原因：
    （1）PCR试剂的扩增效率不是（偏高或偏低），通常情况是扩增效率低于，常见的原因是酶的活性不足、引物探针欠合理或反应液非佳条件，导致实际扩增CT值比理论值滞后，这时斜率会大于3.32。
    （2）试剂盒的标准品溯源定值不准确。4个标准品的赋值是按照10倍或100倍的理论值确定，但实际配制浓度存在逐渐偏高或偏低的情况，或标准品在保存过程中出现不均一的降解，出现本来按照10倍稀释的标准品，实际测定值似乎是按照11倍进行稀释的情况。当然也存在按照9倍稀释的斜率。
    在实际工作中，斜率发生偏倚，
    是否需要调整？调整的标准是什么？
    先要判断斜率偏倚的原因，对准确进行10倍稀释的核酸或阳性样本，采用性能确定的试剂盒进行扩增，如果实测标准品的斜率大于3.32，说明试剂盒的扩增效率低于，如果斜率超过3.6，说明试剂盒的质量存在问题，理应换，此时进行斜率调整并不能解决问题。
    如果是因操作误差或试剂盒标准品降解等因素导致的斜率偏倚，可以参照实验室的室内质控品进行个别调整，如果斜率能控制在3.20~3.6之间，实际检测结果的变化不会对临床报告的准确性产生明显影响。因操作不当导致斜率偏倚，在结果分析中调整斜率，是十分必要的事情，但要依据明确，不能一概而论全部进行调整。
    斜率低于3.0或高于3.6均导致高浓度和低浓度样本的报告值发生较大偏斜。因此，使用斜率控制检测质量，是每个实验室都应重视的方面。
    扩增效率的计算
    经常我们看到有的PCR扩增仪器有扩增效率的参数，但在实际工作中大多不为人知或去科学使用。我们知道，PCR的原理是指数扩增，每扩增一个循环，核酸的量增加一倍，即呈2的n次方,荧光曲线之间的间距由等式“2的n次方=稀释倍数”决定。
    这里的n是标准曲线之间的CT值，如果标准曲线之间的稀释倍数是10倍，那么2的n次方=10，因此n=3.32，即10倍稀释的PCR扩增效率理论值为间隔3.32个CT值，也是4个标准品形成的斜率值。
    有的PCR扩增仪用百分率表示扩增效率，即每个循环有效扩增模板的百分率，扩增效率%=（E-1）×，理想的扩增效率是：扩增效率（%）=（2-1）×=。
    例如，如果标准品的斜率是3.5，那么E=10的(1/-3.5)次方=1.931, 扩增效率（%）=（1.931-1）×=93.1%，每个循环的终点，扩增子的拷贝数每个循环增加1.931倍，或93.1%的模板被扩增。
    扩增效率的应用
    扩增效率超越90~105%范围的影响因素有许多，如果扩增效率下降，常见原因是扩增试剂盒里的引物和探针设计不当，导致与模板的匹配效率较低。实验室经常采用这种方式检验所用试剂盒的质量。如果检测试剂盒标准品的扩增效率超过，很可能是标准品稀释倍数存在问题，即本应10倍稀释的标准品，实际进行了不足10倍的稀释，当然也存在标准品稳定性较差的情况，这都将导致低值样本的假性升高。
    关于室内质控品的选择及CV值
    室内质控是评价或发现一个实验室检测稳定性的主要方式，质控品可以来自购买商品，也可以自行制作，但都应确定自身稳定性是否良好。稀释介质决定了质控品的稳定性，这是让许多企业和实验室头疼的问题，其实无论DNA样本还是RNA样本，配制一个稳定性良好的介质并不困难。
    还有质控品的数量和浓度的择，无论是否有文件规定，选择一个低值样本进行室内质控是完全科学可行的，因为中、高浓度的室内质控品，尤其是高于试剂盒定量限3个数量级以上的室内质控品，对质量控制几乎没有任何意义。
    低值室内质控品的浓度可以根据试剂盒的定量限来确定，对自信度比较高的实验室，完全可以选择试剂盒定量限10倍的样本作为室内质控品，也可以采用定量限20倍的样本。例如，如果试剂盒的定量限为20IU/mL, 质控品的浓度选择为200 IU/mL~400 IU/mL。至于CV值，自然应该符合<5%的要求。

                                                                             （本文内容来源于网络，如有侵权请联系删除）