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非洲猪瘟检测配套仪器的检测程序

发布时间:2019-04-23浏览次数:2274返回列表

非洲猪瘟病毒虽然在环境中比较稳定,但在猪肉烹煮处理过程中较易失活,70℃-75℃加热30分钟以上,病毒就会被杀灭,也就是说我们日常烹饪过程中只要把猪肉熟透(包括中间部位温度至少达到70℃以上),即使有病毒也会很快失去感染力并丧失活性。今天我们主要介绍非洲猪瘟检测配套仪器的检测程序。
一、实验材料
ASF的易感动物,主要为家猪、野猪和蜱,通常采集的样品为家猪、野猪的血液样品、组织样品以及蜱三类。田间采集的样品通常需要经过简单的预处理,才能进行后续的检测、诊断工作。
血清:用于病毒核酸检测、病毒抗原和抗体检测。将采好的猪血的注射器或采血管在室温下倾斜静止2~4h(防止暴晒),或置于37℃温箱内1h,待大部分血清析出后,取出血清,必要时经离心分离血清。(低建议量5ml)。
抗凝全血:用于病毒核酸检测和病毒抗原检测。
采血前,在真空采血管或注射器内按比例加入抗凝剂。采集血液,轻轻上下颠倒,使血液与抗凝剂充分混匀,防止血液凝固的同时避免溶血。也可以将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内,震荡脱落纤维蛋白。必要时,可加入双抗以抑制血源性或采血过程中可能出现的细菌污染。
当血样用于病毒核酸检测时,一般不用肝素而选用EDTA作为抗凝剂。(低建议量1mL)。
组织样本:活体采集,采用扁桃体,用于临床健康动物ASF监测。
尸体剖检ASF发病动物或死亡动物经解剖取材,包括:ASFV靶器官的采集:脾脏、淋巴结、肾脏、扁桃体。
其他病变组织脏器的采集:采集具有明显病变的肝脏、肺脏、心脏等组织器官,选取部位在病变和健康组织交界处。
腐败动物尸体的样品采集:剖检取股骨,将附着的肌肉和韧带等全部剔除,采集骨髓。低建议量5克。
蜱的采集:蜱可进行核酸检测、抗原检测和蜱的形态学鉴定,查找猪圈的墙边、墙缝、木质或瓦质的屋顶,或挖掘猪圈地面均可能找到蜱,也可查看猪表皮,采集蜱。
1-1样品保存条件

注:用于病毒分离和病理学检测的样品禁止-20℃保存。
二、实验器材和试剂
1、台式高速冷冻离心机、组织研磨仪、水浴锅、计时器、冰箱和移液器等。
2、无菌的剪子、镊子、钢珠、2mLEP管、移液器吸头(10μL,200μL、1000μL)等。
3、其他试剂和耗材主要包括:0.01mol/LPBS(PH7.2)、0.8%NaOH、75%酒精棉球等。
三、样品处理程序
1、血清及全血样品处理
取血清或全血样品1mL于灭菌EP管里,保存备用
2、组织样品处理
适用于脾脏等组织样品和蜱的处理。尽可能减少污染,每取一个组织块或蜱,用火焰消毒剪镊等取样器械,组织块应分别放入灭菌容器内并立即密封,做好标记,注意防止组织间相互污染。
3、组织样品的处理应在二级生物安全柜中进行,勿使液体溅到生物安全柜中。
4、将0.1-0.2g组织块放入2mLEP管中,用剪刀剪成碎块,加1-2mL0.01mol/L PBS(PH7.2),再加入1-2粒灭菌钢珠,密封后,表面消毒备用。剩余样品放回容器内,重新密封,表面消毒后保存-70℃冰箱。
5、组织样品的破碎可以利用组织研磨仪在生物安全柜外操作,将样品制成组织悬液。
四、病毒灭活
病毒的灭活处理应在二级生物安全柜中进行,将处理好的血清、全血或者研磨破碎后的组织样品连同EP管放入60℃水浴中,放置30min灭活。
五、使用后仪器处理
剪刀、镊子等均应放入消毒缸进行消毒,放入铁饭盒内,并装入密封袋内进行高压灭菌处理。装有组织样品保存液的容器和盛有组织块的离心管应密封管口,表面消毒后放入密封袋中高压灭菌。钢珠、吸头等废弃物应用0.8%NaOH浸泡30分钟消毒后,置密封袋内高压灭菌。消毒残液应装入密封容器内高压灭菌处理。
六、注意事项
操作之前要确认生物安全柜和实验室已进行了彻底的卫生消毒处理,防止样品间交叉感染。