间充质干细胞诱导分化为软骨细胞团试验
发布时间：2016-01-26浏览次数：1117返回列表
间充质干细胞诱导分化为软骨细胞团试验
1．材料
(1)培养的MSC。
(2)诱导软骨细胞的不完全培养液DMEM(高糖)培养液中加入0．1μmol／L地塞米松、1mmol／L丙酮酸钠、O．17mmol／L维生素2磷酸盐、0．35Mmol／L脯氨酸、6．25μg／ml牛胰岛素、6．25μg/ml转铁蛋白、6．25μg／ml、5．33μg/ml亚油酸、1．25mg／ml BSA。
(3)诱导软骨细胞的完全培养液在上述不完全培养液中加入O．01μg／ml转化生长因子(transforming growth factor，TGF)一β3(新鲜配制并于12 h内用完)。
(4)试剂1mmol／L地塞米松储存液，用无水乙醇配制。20μg／ml TGF—β3储存液，用10mmol／L HCl-10％乙醇配制，放人一70℃冰箱冻存。
(5)器具各种吸管、塑料带盖培养管。
2．方法
(1)取2．5×105个MSC转移至聚丙烯塑料培养管中(利于形成软骨细胞团)，用诱导软骨细胞的不完全培养液洗。MSC2次，即于室温下500r／min离心5min，弃上清液。重新加入1ml不完全培养液使细胞悬浮，使细胞浓度为1×106／ml，经500r／min离心5min，弃上清液。此时加诱导软骨细胞的完全培养液使细胞悬浮，调整细胞浓度为5×105／ml。
(2)15 ml聚丙烯管中加入0．5 ml细胞悬液(相当于2．5×lO5个细胞)，于室温下500r／min。离心5min(勿需弃上清液或悬浮细胞)，拧松瓶盖使之通气，置于37℃、5％C02孵箱中静置培养。
(3)每隔2～3d换全部培养液，可防止细胞团丢失。用无菌吸管轻轻吸出培养液，加O．15ml新鲜配制的完全培养液，轻弹培养液的底部，使细胞团漂起，拧松瓶盖，置于37℃、5％CO2孵箱中静置培养。
(4)培养2～4周后收集软骨细胞团。因培养时间较长，注意无菌操作。如取出细胞操作时应先拧紧瓶盖，防止污染。
3．结果及鉴定 软骨细胞团鉴定时，先用40％甲醛固定细胞团，并行免疫组化检测，或冰冻切片，用番红(safranine)进行葡萄糖胺多糖染色，或用L型胶原免疫染色进行鉴定等。
1．材料
(1)培养的MSC。
(2)诱导软骨细胞的不完全培养液DMEM(高糖)培养液中加入0．1μmol／L地塞米松、1mmol／L丙酮酸钠、O．17mmol／L维生素2磷酸盐、0．35Mmol／L脯氨酸、6．25μg／ml牛胰岛素、6．25μg/ml转铁蛋白、6．25μg／ml、5．33μg/ml亚油酸、1．25mg／ml BSA。
(3)诱导软骨细胞的完全培养液在上述不完全培养液中加入O．01μg／ml转化生长因子(transforming growth factor，TGF)一β3(新鲜配制并于12 h内用完)。
(4)试剂1mmol／L地塞米松储存液，用无水乙醇配制。20μg／ml TGF—β3储存液，用10mmol／L HCl-10％乙醇配制，放人一70℃冰箱冻存。
(5)器具各种吸管、塑料带盖培养管。
2．方法
(1)取2．5×105个MSC转移至聚丙烯塑料培养管中(利于形成软骨细胞团)，用诱导软骨细胞的不完全培养液洗。MSC2次，即于室温下500r／min离心5min，弃上清液。重新加入1ml不完全培养液使细胞悬浮，使细胞浓度为1×106／ml，经500r／min离心5min，弃上清液。此时加诱导软骨细胞的完全培养液使细胞悬浮，调整细胞浓度为5×105／ml。
(2)15 ml聚丙烯管中加入0．5 ml细胞悬液(相当于2．5×lO5个细胞)，于室温下500r／min。离心5min(勿需弃上清液或悬浮细胞)，拧松瓶盖使之通气，置于37℃、5％C02孵箱中静置培养。
(3)每隔2～3d换全部培养液，可防止细胞团丢失。用无菌吸管轻轻吸出培养液，加O．15ml新鲜配制的完全培养液，轻弹培养液的底部，使细胞团漂起，拧松瓶盖，置于37℃、5％CO2孵箱中静置培养。
(4)培养2～4周后收集软骨细胞团。因培养时间较长，注意无菌操作。如取出细胞操作时应先拧紧瓶盖，防止污染。
3．结果及鉴定 软骨细胞团鉴定时，先用40％甲醛固定细胞团，并行免疫组化检测，或冰冻切片，用番红(safranine)进行葡萄糖胺多糖染色，或用L型胶原免疫染色进行鉴定等。
