肝细胞体外培养去分化过过程中转录因子表达谱分析
发布时间：2018-04-26浏览次数：1296返回列表
未来对于肝实质细胞去分化的研究可以综合运用转录组学、蛋白质组学、代谢组学和其他组学方法，提供关于肝实质细胞的了解，提供更客观的分析结果。本研究比较了肝实质细胞的单独培养和共培养，开发出细胞培养-TFs 快速鉴定模型。该模型可以有效获得肝实质细胞体外培养 TFs 表达谱，并对其进行初步分析，发现与非实质细胞共培养可以改善实质细胞生存环境并延缓肝实质细胞代谢的下调。在两种培养系统中表达上调的 TFs 和细胞增殖、免疫、死亡等过程相关，而下调的 TFs 则与代谢过程相关。未来这一模型可以为探究肝实质细胞去分化机制提供更多的证据，共培养系统可以帮助我们了解各种细胞之间的相互作用。
大规模监测这些转录因子的动态变化有助于进一步了解肝实质细胞体外去分化过程。应激诱导细胞存活通路的上调在肝实质细胞损伤和功能丢失过程中起重要作用，比如 MEK/ERK 和 NF-κB 途径对肝实质细胞表型起负调控作用。因此在培养过程中的所有阶段，特别是在肝细胞分离过程中，减少细胞应激反应可能是体外维持细胞活性和肝实质细胞表型的可行的方法。本研究中得到的一些结果可能对于单层培养系统是特异的，但使用这样简单的系统可以帮助我们鉴定已知的和未知的去分化机制，了解肝实质细胞去分化过程。
在小鼠灌流过程中，肝脏会出现缺血再灌注 (Ischemia reperfusion，I/R) 损伤，TNF-α 诱导活性氧的产生进一步促进转录因子 NF-κB 的活化，NF-κB 通路被激活，进而增强 NF-κB 介导的 BCL-2 家族成员比如 BAK、BAX 和 BAD 的转录过程，导致细胞在培养过程中趋向凋亡。整体将差异显著的 TFs 进行功能聚类，发现共培养可以延缓代谢的失调。我们也鉴定到另外一些和代谢、增殖相关的重要的转录因子，如 HNF-1α、CEBPα、 E2F3、RB1 等。
肝原代细胞体外培养会下调重要的LETF蛋白水平，例如HNF-1α 和 HNF-4α，其控制许多物动力学过程和肝实质细胞特有的其他特征。 HNF-4α 是在肝脏里面表达很丰富的TF，参与调控脂肪酸氧化、载脂蛋白代谢、葡萄糖代谢、氨基酸代谢、血液凝结等。
对单独培养和共培养的肝实质细胞TFs进行富集鉴定，发现0h鉴定到的TFs相对于其他时间点偏少，原因可能是正常的肝实质细胞存在较多的高丰度蛋白 (比如白蛋白)，导致一些低丰度的TFs检测不到。另外相对于0h，对其他时间点多出的TFs进行功能聚类分析发现，这些TFs显著富集到MAPK、细胞周期、NF-κB 通路上。另外共培养在 24 h 和 48 h 鉴定到的TFs多于单独培养，至于确切原因还不清楚，需要进一步探索。
我们在 TFRE 方法的基础上，开发出可以富集微量样品中 TFs 的TOT方法。这种方法允许提取培养在6孔板中细胞的TFs，解决样品量少的问题，提高了实验通量。体外 TOT 富集联合质谱鉴定能在很短时间内获取TFs表达谱。从样品制备到数据采集整个过程可以在3 h内完成，其中包含大约1h的质谱检测时间。由于实验都是在TOT和离心机中进行，所以可以一次处理多个样品。TOT目前可以有效获得内源性TFs 表达谱，相信以后随着技术的改善，会有越来越多的TFs被鉴定到。同时我们构建肝细胞的单独培养和共培养系统，初步探究了非实质细胞在体外培养过程中对实质细胞的作用，非实质细胞的存在可以改善实质细胞的存活和形态。
肝实质细胞在体外培养过程中会大量死亡，导致只能获得少量的肝实质细胞，TFs 在细胞内属于低丰度蛋白，监测 TFs 在细胞内蛋白水平上的动态变化变得非常困难。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1(HMGCS1)ELISA试剂盒 ，英文名： HMGCS1 ELISA Kit
3-葡萄糖苷酸孕二醇(PdG)ELISA试剂盒 ，英文名： PdG ELISA Kit
28S抗核糖体抗体(28S rRNP)ELISA试剂盒 ，英文名： 28S rRNP ELISA Kit
26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)ELISA试剂盒 ，英文名： PSMD11 ELISA Kit
26S蛋白酶体(26S PSM)ELISA试剂盒 ，英文名： 26S PSM ELISA Kit
25羟基维生素D3(25(OH)D3/25 HVD3)ELISA试剂盒 ，英文名： 25(OH)D3/25 HVD3 ELISA Kit
25羟基维生素D3(25 HVD3)ELISA试剂盒 ，英文名： 25 HVD3 ELISA Kit
25羟基维生素D2(25 HVD2)ELISA试剂盒 ，英文名： 25 HVD2 ELISA Kit
20S蛋白酶体(20SP)ELISA试剂盒 ，英文名： 20SP ELISA Kit
2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)ELISA试剂盒 ，英文名： 2，3-DPG ELISA Kit
2，3－二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒 ，英文名： 2,3-DPG ELISA Kit
2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒 ，英文名： 2,3-DPG ELISA Kit
2,3Dinor血栓烷B2(2,3-dinor-TXB2)ELISA试剂盒 ，英文名： 2,3-dinor-TXB2 ELISA Kit
2 型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)(IMPDH2)ELISA试剂盒 ，英文名： IMPDH2 ELISA Kit
1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)ELISA试剂盒 ，英文名： S1P1 ELISA Kit
17酮皮质类固醇(17-KS)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-KS ELISA Kit
17-酮类固醇(17-KS)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-KS ELISA Kit
17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-OHP ELISA Kit
17羟皮质类固醇(17-OHCS)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-OHCS ELISA Kit
17-α-羟化酶(17-α-OH)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-α-OH ELISA Kit
16α羟基雌酮1(16-α OHE-1)ELISA试剂盒 ，英文名： 16-α OHE-1 ELISA Kit
15脂加氧酶(15-LO/LOX)ELISA试剂盒 ，英文名： 15-LO/LOX ELISA Kit
15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)ELISA试剂盒 ，英文名： 15-PGDH ELISA Kit
15-epi-氧脂素 A4(15-epi-LXA4)ELISA试剂盒 ，英文名： 15-epi-LXA4 ELISA Kit
14-3-3蛋白(14-3-3 pro)ELISA试剂盒 ，英文名： 14-3-3 pro ELISA Kit
14-3-3 蛋白 beta/alpha(YWHAB)ELISA试剂盒 ，英文名： YWHAB ELISA Kit
12-脂氧化酶/脂加氧酶(LOX-12)ELISA试剂盒 ，英文名： LOX-12 ELISA Kit
12羟二十烷四烯酸(12-HETE)ELISA试剂盒 ，英文名： 12-HETE ELISA Kit
11去氢血栓烷B2(11-DH-TXB2)ELISA试剂盒 ，英文名： 11-DH-TXB2 ELISA Kit
大规模监测这些转录因子的动态变化有助于进一步了解肝实质细胞体外去分化过程。应激诱导细胞存活通路的上调在肝实质细胞损伤和功能丢失过程中起重要作用，比如 MEK/ERK 和 NF-κB 途径对肝实质细胞表型起负调控作用。因此在培养过程中的所有阶段，特别是在肝细胞分离过程中，减少细胞应激反应可能是体外维持细胞活性和肝实质细胞表型的可行的方法。本研究中得到的一些结果可能对于单层培养系统是特异的，但使用这样简单的系统可以帮助我们鉴定已知的和未知的去分化机制，了解肝实质细胞去分化过程。
在小鼠灌流过程中，肝脏会出现缺血再灌注 (Ischemia reperfusion，I/R) 损伤，TNF-α 诱导活性氧的产生进一步促进转录因子 NF-κB 的活化，NF-κB 通路被激活，进而增强 NF-κB 介导的 BCL-2 家族成员比如 BAK、BAX 和 BAD 的转录过程，导致细胞在培养过程中趋向凋亡。整体将差异显著的 TFs 进行功能聚类，发现共培养可以延缓代谢的失调。我们也鉴定到另外一些和代谢、增殖相关的重要的转录因子，如 HNF-1α、CEBPα、 E2F3、RB1 等。
肝原代细胞体外培养会下调重要的LETF蛋白水平，例如HNF-1α 和 HNF-4α，其控制许多物动力学过程和肝实质细胞特有的其他特征。 HNF-4α 是在肝脏里面表达很丰富的TF，参与调控脂肪酸氧化、载脂蛋白代谢、葡萄糖代谢、氨基酸代谢、血液凝结等。
对单独培养和共培养的肝实质细胞TFs进行富集鉴定，发现0h鉴定到的TFs相对于其他时间点偏少，原因可能是正常的肝实质细胞存在较多的高丰度蛋白 (比如白蛋白)，导致一些低丰度的TFs检测不到。另外相对于0h，对其他时间点多出的TFs进行功能聚类分析发现，这些TFs显著富集到MAPK、细胞周期、NF-κB 通路上。另外共培养在 24 h 和 48 h 鉴定到的TFs多于单独培养，至于确切原因还不清楚，需要进一步探索。
我们在 TFRE 方法的基础上，开发出可以富集微量样品中 TFs 的TOT方法。这种方法允许提取培养在6孔板中细胞的TFs，解决样品量少的问题，提高了实验通量。体外 TOT 富集联合质谱鉴定能在很短时间内获取TFs表达谱。从样品制备到数据采集整个过程可以在3 h内完成，其中包含大约1h的质谱检测时间。由于实验都是在TOT和离心机中进行，所以可以一次处理多个样品。TOT目前可以有效获得内源性TFs 表达谱，相信以后随着技术的改善，会有越来越多的TFs被鉴定到。同时我们构建肝细胞的单独培养和共培养系统，初步探究了非实质细胞在体外培养过程中对实质细胞的作用，非实质细胞的存在可以改善实质细胞的存活和形态。
肝实质细胞在体外培养过程中会大量死亡，导致只能获得少量的肝实质细胞，TFs 在细胞内属于低丰度蛋白，监测 TFs 在细胞内蛋白水平上的动态变化变得非常困难。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1(HMGCS1)ELISA试剂盒 ，英文名： HMGCS1 ELISA Kit
3-葡萄糖苷酸孕二醇(PdG)ELISA试剂盒 ，英文名： PdG ELISA Kit
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25羟基维生素D2(25 HVD2)ELISA试剂盒 ，英文名： 25 HVD2 ELISA Kit
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2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)ELISA试剂盒 ，英文名： 2，3-DPG ELISA Kit
2，3－二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA试剂盒 ，英文名： 2,3-DPG ELISA Kit
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17酮皮质类固醇(17-KS)ELISA试剂盒 ，英文名： 17-KS ELISA Kit
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