细胞冻存和复苏

  细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以zui大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好，针对细胞复苏，1. 可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1小时； 2. 为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上； 3. 水浴温度40℃应该也没问题，但正规的protocol上从来都只说37℃。

一、冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

二、慢冻程序

1.  标准程序：采用细胞冻存器

当温度在-25 ℃以上时，  1~2 ℃/min；

当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。

2.  简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。

3.  传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽长期储存。

三、低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

四、细胞冻存方法

1.  预先配制冻存液

（1）10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）

（2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）

2.  取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）。

3.  加入1 ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮长期保存。

五、保存细胞的复苏方法

1.  快速解冻

冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。

2.  解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。

3.  如果细胞对冷冻保护剂特别敏感

解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。