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ELISA主要检测方法剖析

发布时间:2023-05-04浏览次数:709返回列表

ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。ELISA检测类型主要的有四种,直接法、间接法、夹心法和竞争法。


1、ELISA直接法

在ELISA直接法中,样品中的抗原或抗体以非特异性方式直接吸附在包被板上。然后,将特异性测定抗体或抗原连接到孔中。之后,测定底物被用来产生可测量的颜色变化,并在读板器上进行量化。


由于这种检测方法步骤少,速度快,而且比其他ELISA方法少有机会引入错误。然而,由于吸附步骤是非特异性的,背景噪音可能很高。没有二级抗体步骤意味着没有信号放大,降低了检测灵敏度。它还需要为每个所需目标创建共轭测定抗体/抗原。


2、ELISA间接法

ELISA间接法,或称iELISA,初于1978年开发,用于检测人血清白蛋白,其工作方式与ELISA直接法非常相似,只是增加了一个二级抗体步骤。这使得测试信号得到放大,克服了ELISA直接法的局限性。


它还否定了对目标特异性共轭测定抗体/抗原的需要,因为共轭的二级抗体只需要对一级抗体具有物种特异性。如果总的样品抗原被结合到包被板上,就像ELISA直接法一样,背景噪音仍然是一个问题。


然而,如果该检测方法用于检测样品抗体,纯化的目标抗原被涂在板上,而一级抗体来自于样品。这大大减少了背景噪音,因此这些检测方法在确定样品中的抗体滴度时受欢迎。


ELISA间接法的缺点包括方案时间较长,有多出错机会,以及可能与二级抗体产生交叉反应。


3、ELISA夹心法

顾名思义,ELISA夹心法将抗原夹在抗体之间,该技术开发于1977年,可以采用ELISA直接或间接法的形式(上面描述的ELISA夹心法是基于ELISA间接法),除了抗原与检测板的非特异性结合,捕获抗体使其成为一个特异性的过程。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性。


然而,它们确实需要确定兼容的捕获和测定抗体对才能有效地发挥作用,而且可能有交叉反应的问题。这种检测方法通常也有多的步骤,提供了大的出错机会。由于抗原结合步骤的选择性,ELISA夹心法在抗原处于复杂混合状态时特别有用,因为不需要纯化抗原。


4、ELISA竞争法

ELISA竞争法,也被称为ELISA抑制法或ELISA阻断法,可能是ELISA技术中复杂的一种。


初是在1976年为检测人类绒毛膜促性腺激素而开发的,该检测方法通过检测对预期输出信号水平的干扰,产生一个反比关系。应用的样品中目标物越多,测定的输出信号就越低。


其他ELISA方法也可以被改变为竞争法。这里有两个一般的原则:样品抗原或抗体与参照物竞争,分别与有限数量的标记抗体或抗原结合;又或者,样品抗原或抗体可以与标记参照物竞争,分别与有限数量的抗体或抗原结合。


ELISA竞争法与它所采用的形式一样,具有一些相同的优点和缺点。然而,当抗原较小,限制了两个抗体同时结合的能力(如ELISA夹心法所要求的),或者只有一个抗体可用时,它的作用就凸显了出来。

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