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第六节 无蛋白培养基与限定化学成分培养基

一、无蛋白培养基（protein free midium,PFM）：即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质终要应用于人体，如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。人高转移肺癌细胞

二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM)：是指培养基中的素有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世，上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM。

T-47D细胞，人乳腺管癌细胞

CCD-1095Sk细胞，人乳腺浸润性导管癌旁皮肤细胞

SK-BR-3*细胞，人乳腺腺癌细胞

SW 1353细胞，人软骨肉瘤细胞

GNM 细胞，人上颌牙龈癌颈淋巴结转移癌细胞

T6细胞，人舌癌细胞

TSCCA细胞，人舌鳞癌细胞

CAL 27细胞，人舌鳞癌细胞

Tca-8113细胞，人舌鳞癌细胞

TSCCa细胞，人舌鳞癌细胞

CRT 细胞，人神经胶质瘤细胞

U251细胞，人神经胶质瘤细胞

SH-SY5Y细胞，人神经瘤细胞

BE(2)-M17细胞，人神经母瘤细胞

CRL-2268细胞，人神经母瘤细胞

IMR-32细胞，人神经母瘤细胞

SH-5Y5Y细胞，人神经母瘤细胞

SK-N-AS细胞，人神经母瘤细胞

SK-N-BE(2)细胞，人神经母瘤细胞

SK-N-MC细胞，人神经上皮瘤细胞

A-498细胞，人肾癌细胞

A498-EGFP-puro细胞，人肾癌细胞

ACHN细胞，人肾癌细胞

KC细胞，人肾癌细胞

OS-RC-2细胞，人肾癌细胞

G-401细胞，人肾癌Wilms细胞

SK-NEP-1细胞，人肾母瘤细胞

SW-13细胞，人肾上腺皮质癌细胞

NCI-H295R细胞，人肾上腺皮质腺癌细胞

KP-N-NS细胞，人肾上腺神经母瘤(脑转移)细胞

NCI-H205细胞，人肾上腺腺瘤细胞

786-O(786-0)细胞，人肾透明癌细胞

CaKi-1细胞，人肾透明癌细胞

CaKi-2细胞，人肾透明癌细胞

786-0细胞，人肾透明腺癌细胞

ACHN细胞，人肾透明腺癌细胞

769-P细胞，人肾腺癌细胞

HuTu-80细胞，人十二脂肠腺癌细胞

CaES-17细胞，人食管癌细胞第七节 其他细胞培养用液

在细胞培养过程中，除了培养基外，还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。

一、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。简单的BSS是Ringer。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2.2g/L),适合于5%CO₂ 的培养条件，Hank's平衡液仅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用于5%CO₂的环境，若放入CO₂培养相，溶液将迅速变酸，使用时应注意。

配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca²⁺、Mg²⁺，应当先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。

二、消化液：取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的平衡盐溶液（如前面的D-Hank's），因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的佳pH是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后可以再调只pH7.5，也可不调。

使用细胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的细胞清洗液（100ml细胞清洗液加0.5g胰酶），过滤除菌，分装于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。

3、胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的佳pH为6.5。胶原酶不受Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的抑制，配制时可用PBS。

三、pH调整液:常用的有HEPES液和NaHCO₃溶液。

1、NaHCO₃溶液：NaHCO₃是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO₂的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO₂的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO₃。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。

2、HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO₂的环境，CO₂ 气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度0.01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。

五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30℃，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于－20℃。使用时，在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在细胞培养液中L-谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解；需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常：

（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；

（2）过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨少!

二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。二肽谷氨酰胺是优替代物，它无需适应；既可用于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养。

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