TaqDNA聚合酶产品及特点:
本产品是Thermus aquaticus (水生栖热菌)的DNA聚合酶基因在E. coli 中表达而得,具有以双链DNA为模板的5→3聚合酶活性和5→3外切酶活性。Taq DNA聚合酶长为832个氨基酸,分子量为 94 Kd。该酶可以广泛用于PCR、RT-PCR和加尾反应等。其特点如下:
1. 具耐热DNA聚合活性。该酶在90℃以上几乎无DNA合成,在75~80℃时延伸率约150个核苷酸/秒,70℃时为60个核苷酸/秒,55℃时为24个核苷酸/秒。在65-68℃并有Mn2+存在时还具有逆转录活性。
2. 热稳定。在PCR混合物中95℃保温40 分钟仍可保持50%的活性。
3. Mg2+离子依赖性。MgCl2浓度在2.0 mM时该酶催化活性*。
4. 本酶无3→5外切活性,不具3→5校对功能,碱基错配机率为2.1×10-4。
Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)质控标准
1. 功能检测,以λ DNA为模板,特定引物扩增2-20 Kb PCR片段。
2. 核酸内切酶活性检测(切刻酶活力),在50 μL反应缓冲液中,将20单位的酶和1 μ g ΦX174 RFⅠ型DNA于 72℃ 或37℃条件下共育4小时,<5%的DNA转变为RFⅡ型。
3. 核酸外切酶活性,在50 μ L反应缓冲液中,将20单位的酶和1 μ g λ DNA/HindⅢ消化产物于72℃ 或37℃条件下共育4小时,没有观察到明显带型变化。
4. 核酸酶活性检测:在50 μL反应缓冲液中,将1 μg λ DNA与20单位的酶于72℃保温16小时,无明显DNA降解发生。
Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)操作步骤
(一)获得目的基因
1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1、Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表达
1、 Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。
5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
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