肝素辅因子Ⅱ的实验原理方法
原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)水平。用纯化的人肝
素辅因子Ⅱ(HCⅡ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肝素辅
因子Ⅱ(HCⅡ)，再与HRP 标记的肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体
复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸
的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)呈正相关。用酶
标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人肝素辅因子Ⅱ(HC
Ⅱ)含量。
方法
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从一孔、第二
孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉，再各取50μl 分别加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各
取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混
匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准
品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，
浓度分别为120 pg/mL，80 pg/mL ，40 pg/mL，20 pg/mL，10pg/mL）。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样
品终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混
匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此
重复5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15 分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
