肠道病毒71 型B5 亚型（EV71-B5）核酸测定试剂盒
（荧光PCR 法）
Genotype B5 of Enterovirus 71(EV71-B5)Real Time RT-PCR Kit
【产品名称】
通用名称：肠道病毒71 型B5 亚型核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）
英文名称：Genotype B5 of Enterovirus 71(EV71-B5)Real Time RT-PCR Kit
【包装规格】25 人份／盒
【检验原理】 本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）技术结合荧光探针技术，对肠道病毒71 型B5 亚型特异性核酸片段进行荧光PCR检测。
【预期用途】通过对样本中肠道病毒 71 型B5 亚型的特异性RNA核酸片段进行定性检测，可用于临床对可疑感染患者的病原学鉴别诊断。
【试剂盒主要组成成份】
序号组分 数量体积／人份
1 EV71-B5 核酸荧光PCR 检测混合液 480ml×1 19ml
2 RT-PCR 酶 28ml×1 1ml
3 DEPC-H2O 400ml×1
4 阳性对照品 30ml×1
说明：不同批号的组分不可以互换使用。
自备试剂：Trizol；lv仿；75%乙醇；异丙醇或磁珠法RNA 提取试剂；本公司可以代为订购或提供销售商联系方式。
【储存条件和有效期】试剂盒应在－20℃及以下温度避光保存，有效期12 个月。采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封进行运输；荧光PCR检测混合液反复冻融不宜超过3 次。
【适用仪器】 本试剂盒适用于Slan；PE5700，MJ-Opticon 等单色荧光PCR 仪；ABI7000，ABI7300，ABI7500，ABI7900，MJ-chromo4，MX3000P，MX3005P，SmartCyclerⅡ，Rotor-Gene6000，LightCylerR480，iCycleriQ4，iCycleriQ5 等多色荧光PCR 仪及相应软件。
【标本要求】
1．上呼吸道感染症状（发热、喷嚏、流涕、咳嗽等）：用灭菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，将分泌物或咽拭子置入灭菌试管（含0.4ml 灭菌生理盐水），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。标本可立即用于检测，—70 ℃可长期保存，标本不宜反复冻融，应采用低温运送。
2．疱疹性咽峡炎（在咽部、舌、软腭等处出现小疱疹，可伴有扁桃体肿大）；皮疹（主要分布在面部、手指、足趾等处，为疱疹和斑丘疹。）：用漱口液或无菌捻拭子拭取鼻腔、咽部或病疹分泌物，将分泌物或咽拭子置入灭菌试管（含0.4ml灭菌生理盐水），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。标本可立即用于检测，—70 ℃可长期保存，标本不宜反复冻融，应采用低温运送。
3．有脑膜脑炎及病毒性心肌炎：用一次性的针筒抽取病人静脉血2ml，置于灭菌的一次性试管中，取分离出的血清0.2ml 左右送检。或抽取患者脑脊液0.5 ml，置于灭菌的一次性试管中送检。
4．粪便：用灭菌捻拭子拭取粪便或腹泻物置入无菌玻璃管（含0.4ml 灭菌生理盐水），用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。标本可立即用于检测，—70 ℃可长期保存，标本不宜反复冻融，应采用低温运送。
【检验方法】
1. 标本、对照品的核酸裂解处理
（1）用商品化（取得医疗器械许可证）的RNA 提取试剂盒处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书。
（2）或用Trizol 法提取，方法如下：取100ml 样品置于1.5ml 离心管中，加入300ml 裂解液(Trizol)，再加入100ml ， 混匀器上振荡混匀5sec 或颠倒混匀15 次13000rpm 离心15min， 吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温静置10min，13000rpm 离心10min，轻轻倒去上清；加入700ml 75%乙醇，颠倒洗涤，13000rpm离心5min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，弃尽液体或4000rpm离心5sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20ml DEPC-H2O 溶解RNA。DEPC-H2O 作为阴性对照。
2.试剂配制取 n×19ml EV71-B5 核酸荧光PCR 检测混合液与n×1mlRT-PCR 酶(n 为反应管数)，振荡混匀数秒, 3000rpm 离心数秒。
3. 加样取上述混合液20ml 置于薄壁PCR 反应管或PCR 反应板中，然后将已处理标本、阳性对照品、DEPC-H2O 各 5ml 分别加入薄壁PCR 反应管或PCR 反应板中，盖好薄壁PCR 反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR 扩增反应。
4. PCR 扩增反应管置于定量荧光 PCR 仪上，推荐循环参数设置：45℃×10min; 95℃×15min;再按 95℃×15sec→60℃×60sec，循环40 次； 单点荧光检测在60℃，反应体系为25ml。
荧光通道检测选择：选用FAM 通道。
备注：如使用ABI 系列PCR 仪，请务必于passive reference 和quencher 处均选“none”。
5. 基线和阈值设定 基线调整取6-15 个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H2O 的zui高点。
6. 质量控制：试剂盒各对照品须达到以下要求，否则实验视为无效。Ct 值FAM 通道（目的基因）DEPC-H2O UNDET 或40阳性对照品≤35
7. 试验结果的判断
通道Ct 值 结果判断
1 FAM UNDET 或40 样本低于检测限，报告为阴性
2 FAM ≤38 报告为阳性
3 FAM 38～40 复检一次,如仍为38～40,则报告为阴性
【参考值范围】阴性（检测对象EV71 型B5 亚型病毒为病原微生物，在健康人体中不存在）。
【对检验结果的解释】实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性的结果。
【检验方法的局限性】当检测样本中被检核酸浓度含量低于zui低检测限1×104copies/ml 时可能会发生假阴性的结果。
【产品性能指标】zui低检测限：1×104copies/ml。
【注意事项】开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
1. 整个检测过程应严格分在三区进行：PCR 反应体系的配制区；标本处理、加样区；PCR 扩增、荧光检测及结果分析区。各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应专用。实验后即请清洁工作台，并进行消毒。
2. 使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换) 、一次性专用离心管、自卸式移液器和带滤嘴吸头。
3. 试剂准备和标本处理应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境污染。
4. 每次实验应设置阴、阳性对照品。
5. 操作人员应经过专业培训，具有一定经验和操作技能。
6. 操作台、移液器、离心机、PCR 扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%酒精、紫外线灯或臭氧消毒处理。
7. 实验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
8. 试剂使用前应在常温下充分融化并混匀。
9. PCR 反应混合液应避光保存。
10. 反应管中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧。
11. 不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
