组织沉默调节蛋白 3 (SIRT3)活性荧光定量检测试剂盒(中文版)
主要用途
组织沉默调节蛋白 3 (SIRT3)活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆su标记人工合成的乙酰化 p53 多肽底物,经过 SIRT3 脱乙酰基后,被位点特异性氨基肽酶水解,释放释放出具有强烈荧 光的 7-氨-4 甲基香豆su,即采用荧光法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技 术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、线粒体蛋白样品、 部分或完全纯化酶样品中 SIRT3 的活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用, 操作简捷,性能稳定。
技术背景
人体组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase;HDAC)家属分成三类共20多个蛋白:种类I(class I)与酵母 Rpd3蛋白同源,包括HDAC1、2、3、8,存在于细胞核中;种类II(class II)与酵母Hda1蛋白同源,包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR,存在于细胞核和细胞浆里;上述两大种类的蛋白分子催化 结构域含有锌,且曲古菌素A(trichostatin A;TSA)敏感。种类III(class III)为NAD+辅助因子必需,又称为sirtuins,与酵母Sir2(Silent Information Regulator 2)同源,是进化保留的古老的酶类,存在于真核生 物、古生菌(Archaea)和真细菌(Eubacteria)等,包括SIRT1至7等,为曲古菌素A(trichostatin A;TSA) 不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶(lysyl-deacetylase)。催化赖氨酸脱乙酰基反应,以及由NAD+和乙酰(acetyl) 基团转化产生的烟酰胺(nicotinamide)和O-乙酰ADP核糖(O-acetyl-ADP-ribose)。其中可溶性SIRT3位于 细胞线粒体内,体内热量限制(caloric restriction)、寒冷刺激、细胞应激等因素,使成熟且活性Sirt3由细胞 核转移到线粒体,经基质加工肽酶(matrix-processing peptidase)激活,表达增加,作用于乙酰辅酶A合酶2 (acetyl CoA synthetase 2)、UCP1、PGC-1α等天然目标底物,脱乙酰化和激活。其功能在于调节适应性生 热反应(thermogenesis)、确保能量产生、提供乙酸的代谢使用、调节基础ATP水平、调节影响线粒体通透 性的凋亡信号、调节表观遗传基因沉默,是代谢或氧化状态的感应因子,生命延长(life extension)的标志。 Sirt3异常,将导致神经退行性疾病、癌症、衰老、代谢功能异常等疾病。基于人工合成的乙酰化p53多肽底 物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys(Ac)具有抗氨基肽酶切离的功能,先使用荧光染料氨甲基香豆su(aminomethylcoumarin;AMC)来标记乙酰化p53多肽底物,其次进行脱乙酰化,Z后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解,释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆su(7-amino-4-methylcoumarin;AMC)(激发波长350-360nm;散发波长450-465nm),由此来定量测定沉默调节蛋白3的活性。其反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
底物液(Reagent D) 微升
终止液(Reagent E) 微升
酶解液(Reagent F) 微升
补充液(Reagent G) 微升
标准液(Reagent H) 微升2
产品说明书 1 份
保存方式
保存缓冲液(Reagent C)、底物液(Reagent D)、终止液(Reagent E)、酶解液(Reagent F)和标准液(Reagent H)在-20℃冰箱里,避免反复冻融;其余的保存在 4℃冰箱里;底物液(Reagent D)和标准液(Reagent H)避免光照,有效保证 6 月
用户自备
1.5 毫升离心管:用于样品操作和保存的容器
15 毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
5 毫升 DOUNCE 匀浆器:用于裂解细胞
(微型)台式离心机:用于细胞预处理
培养箱:用于反应物孵育
黑色 96 孔板或 100 微升 1 厘米光径比色皿:用于反应和荧光分析的容器
荧光酶标仪或荧光分光光度仪:用于荧光分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备(线粒体蛋白)
1. 手术取出动物组织,并秤重以确定 500 毫克组织重量
2. (选择步骤)放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入 xx 毫升清理液(Reagent A)清洗 1 次
4. 加入 xx 毫升裂解液(Reagent B)
5. 移入到预冷的 5 毫升 DOUNCE 匀浆器
6. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞(约 20 至 40 下)
7. 将所有细胞匀浆物移入 1.5 毫升离心管
8. 放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟,速度为 1500g
9. 小心移出上清液到另一个新的预冷的 1.5 毫升离心管
10.放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟,速度为 10000g
11.小心抽去上清液,保留沉淀颗粒
12.加入 xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀
13.移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
14.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如线粒体蛋白或纯化酶样品等),置于冰槽里
2. 设定好荧光酶标仪或荧光分光光度仪(温度为 30℃):激发波长 350-360nm;散发波长 450-465nm
3. 缓冲液(Reagent C)置于室温下均衡温度
4. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管,标记为 1 至 5 号管3
5. 分别加入 xx 微升缓冲液(Reagent C)到 1 至 5 号管
6. 移取 xx 微升标准液(Reagent H)到 1 号管,混匀
7. 小心移取 xx 微升 1 号管稀释的标准液(Reagent H)到 2 号管,混匀
8. 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的标准液(Reagent H)到 3 号管,混匀
9. 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的标准液(Reagent H)到 4 号管,混匀
10.将 1 至 5 号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表
管号 缓冲液(Reagent C) 标准液(Reagent H) 标准氨甲基香豆su浓度
1 xx 微升 xx 微升 xx 微摩尔/升
2 xx 微升 xx 微升 1 号管 xx 微摩尔/升
3 xx 微升 xx 微升 2 号管 xx 微摩尔/升
4 xx 微升 xx 微升 3 号管 xx 微摩尔/升
5 xx 微升 0 0
三、标准测定
1. 在黑色 96 孔板上做好相应标记:标准样品 1 至 5 管
2. 分别移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到相应孔里
3. 分别加入 xx 微升上述配制的标准液(Reagent H)
4. 轻轻摇动黑色 96 孔板 30 秒
5. 即刻放进荧光酶标仪或转移到 100 微升比色皿,在荧光分光光度仪里检测:获得相对荧光单位(Relative Fluorescence Unit;RFU)读数
6. 构建标准曲线:纵座标(Y 轴)为相对荧光单位(RFU);横座标(X 轴)为标准氨甲基香豆su浓度(微 摩尔/升)
四、活性测定
1. 在黑色 96 孔板上做好相应标记:背景空对照和待测样品
2. 分别移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到相应孔里
3. 分别加入 xx 微升底物液(Reagent D)
4. 分别加入 xx 微升补充液(Reagent G)或待测样品(50 微克线粒体蛋白或 200 微克细胞裂解萃取液总 蛋白)(注意:样品须清澈)
5. 轻轻摇动黑色 96 孔板 30 秒
6. 放进 30℃培养箱里,孵育 60 分钟,避免光照
7. 分别加入 xx 微升终止液(Reagent E)
8. 分别加入 xx 微升酶解液(Reagent F)
9. 轻轻摇动黑色 96 孔板 30 秒
10.在 30℃培养箱里,孵育 30 分钟
11.即刻放进荧光酶标仪或转移到 100 微升 1 厘米光径比色皿,在荧光分光光度仪里检测:获得相对荧光 单位(Relative Fluorescence Unit;RFU)读数
12.根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆su浓度(微摩尔/升)
四、 计算样品活性
方法一:RFU 直接法4
根据样品的荧光读数 RFU 作为样品酶活性单位
方法二:标准氨甲基香豆su浓度测算法
注意事项
1. 本产品为 20 次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,标准测定只需 1 次
4. 注意增益倍数的设置
5. 样品须澄清,至关重要
6. 样品处理时,避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺(alkyl amine)等
7. 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
8. 测定值由低到高变化;测定持续 60 分钟
9. 测定值荧光读数越高,表明酶活性越高
10.荧光测定后,比色皿须清洗彻底
11.待测样本为线粒体蛋白样品,其蛋白浓度为 50 微克/20 微升;待测样本为细胞裂解悬液,其蛋白浓度为 200 微克/20 微升(本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 GMS30030.1)
12.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
13.样品活性计算根据用户要求,选择直接法或测算法;如果选择直接法,可以不必测定标准样品
14.沉默调节蛋白 3 单位活性定义为:在 30℃,pH 8.0 条件下,每分钟内能够释放 1 纳摩尔氨甲基香豆su所需的酶量作为一个活性单位
15.本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司联系,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK, RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息5
单组分订购信息
编号 名称 规格
GMS50290.2 组织沉默调节蛋白 3(SIRT3)活性荧光定量检测试剂盒 20 次
GMS50290.2A 清理液(Reagent A) 毫升
GMS50290.2B 裂解液(Reagent B) 毫升
GMS50290.2C 缓冲液(Reagent C) 毫升
GMS50290.2D 底物液(Reagent D) 微升
GMS50290.2E 终止液(Reagent E) 毫升
GMS50290.2F 酶解液(Reagent F) 毫升
GMS50290.2G 补充液(Reagent G) 毫升
GMS50290.2H 标准液(Reagent H) 微升
试剂盒订购信息
产品编号 名称 规格
GMS50287.1 细胞沉默调节蛋白 1 (SIRT1)活性比色法定量检测试剂盒 20 次
GMS50287.2 组织沉默调节蛋白 1 (SIRT1)活性比色法定量检测试剂盒 20 次
GMS50288.1 细胞沉默调节蛋白 3(SIRT3)活性比色法定量检测试剂盒 20 次
GMS50288.2 组织沉默调节蛋白 3(SIRT3)活性比色法定量检测试剂盒 20 次
GMS50289.1 细胞沉默调节蛋白 1(SIRT1)活性荧光定量检测试剂盒 20 次
GMS50289.2 组织沉默调节蛋白 1(SIRT1)活性荧光定量检测试剂盒 20 次
GMS50290.1 细胞沉默调节蛋白 3(SIRT3)活性荧光定量检测试剂盒 20 次
GMS50290.2 组织沉默调节蛋白 3(SIRT3)活性荧光定量检测试剂盒 20 次