线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法) 实验原理

中文名称：线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)

产品规格：50T/100T

用途：细胞凋亡的生物化学分析，线粒体膜电位检测

注意事项：要由JC-1染料储存液，JC-1 buffer、CCCP等组成，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位，采用FACS检测。

储存条件：-20℃，避光，12个月

检测原理：

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）是一种以JC-1 为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于检测线粒体的健康状态，也是用来检测细胞早期凋亡的常用方法。

是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针。JC-1染料表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。

线粒体膜电势的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸内切酶G（EndoG）、凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C的释放伴随膜电位的完全丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联效应。

JC-1染料的优势：

染料用途广：可用来检测各种细胞类型包括单核细胞和神经细胞，以及完整组织和纯化的线粒体；

染料特异性geng高：与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性geng好；

红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；

检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别；

操作步骤（详细步骤请见说明书）：

1. JC-1 染色工作液的配制

取适量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1 染色工作液。

2. 阳性对照的设置

CCCP（10mM）推荐按照1∶1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3. 线粒体膜电位检测（悬浮细胞）

（1） 取1.0～6.0×105 细胞，重悬于0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

（2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

（3） 孵育期间按照每1mL JC-1染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

（4） 37℃孵育结束后，600g 4℃离心3～4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

（5） 用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2 次：加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。

（6） 再用适量JC-1 染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4. 线粒体膜电位检测（贴壁细胞）

5. 线粒体膜电位检测（纯化的线粒体）

6. 荧光观测和结果分析

注意：

CCCP阳性对照属于线粒体电子传递链抑制剂，有毒性。操作时需避免直接接触皮肤；

为了个人的安全和健康，请戴手套，口罩还有实验服进行操作；