100T T淋巴细胞亚群试剂盒

T细胞是重要的免疫细胞。有仅在细胞免疫中居主导地位，体液免疫也在T细胞的调节之下进行。T细胞通过分泌细胞因子，对机体非特异性免疫也起重要调节作用。

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 一. T细胞亚群及检测的意义

T细胞是重要的免疫细胞。有仅在细胞免疫中居主导地位，体液免疫也在T细胞的调节之下进行。T细胞通过分泌细胞因子，对机体非特异性免疫也起重要调节作用。

T细胞表面有特有的标志性分子，成熟T细胞表面有CD₃分；辅助性T细胞（Th）和诱导性T细胞（Ti）表面除CD₃外还有CD₄分子；抑制性T细胞（Ts）和细胞毒性T细胞（Tc）表面，除CD₃外还有CD₈分子。用相应的特异性抗体，可以指证这些分子的存在，以此区分CD₃阳性T细胞，CD₄阳性T细胞和CD₈阳性T细胞。

机体的免疫功能状态，是由免疫细胞数量、免疫细胞活性、免疫细胞和细胞亚群之间平衡决定的。T细胞亚群检测试剂盒，是用免疫组化方法测定T细胞数量，和CD₄/CD₈比例的。据国外多年观测，白血病、肿瘤、自身免疫病、变态反应、感染症、移植排斥、造血功能障碍，均有T细胞亚群变化异常。测定T细胞亚群，有助于了解机体的免疫功能状态，对一些疾病的诊断、分型、鉴别、预后判断、药物疗效观察，以及疾病的发生发展研究，均有一定的参考价值。下表是T淋巴细胞亚群在临床中的异常变化。

      表 T细胞亚的异常变化

     PBL：外周血淋巴细胞    CSF：脑脊髓液     BALF：支气管肺灌洗液

 二．生物素－亲和素法检测T细胞亚群的优点

 现在T细胞亚群检测试剂盒，免疫组化的显示系统一般采用碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP），敏感度不高。为提高检测效果，需提高一和第二抗体使用浓度，于是又增加了抗体的非特异性吸附，不仅增加非特异性计数，还影响染片本底的清晰。用这种方法当一抗体质量较差时，很难获得准确的结果，这就是当前测定CD₄T细胞遇到的情况。

 本试剂盒所用抗体系从国外进口，显示系统采用zymed公司和sigma公司底物显色液组装而成。主要试剂包括：3种特异性一抗体、生物素标记的抗抗体（第二抗体）、辣根过氧化物酶标记的链亲和素和底物显色液。这种显示系统因增加了生物素-亲和素放大系统，将检测灵敏度提高了40-60倍。在这种显示体系中，反应为：抗原-一抗体-第二抗体-生物素-亲和素-辣根过氧化物酶。酶的显色反应正比于抗原的量。一个亲和素分子可以结合4个生物素分子，故这是一个比二抗更大的放大系统。另外，由于生物素和亲和素之间的亲和性高，相当抗原—抗体间的10000倍以上，所以它们结合特异、专一、和不可逆，这是使检测灵敏度提高的另一原因。由于亲和性强，一第二抗体的使用浓度降低，减少了非特异结合干扰，使染片背景更清晰。

本显示系统使用AEC为底物，阳性细胞着亮红色，与非阳性细胞色差对比明显，易于观察和记数。

三．T细胞亚群检测试剂盒的组成

四．细胞的收集与分离

1.     无菌取血2ml,肝素抗凝,加入0.9%生理盐水或0.01M PBS(pH7.2-7.4)稀释至5ml,缓慢叠加在含有3ml淋巴细胞分离液(d=1.077)的上面,使标本与淋巴细胞分离液之间形成清晰层面。

2.     室温650-750×g(1900-2100rpm,r=15cm)离心20min后,见到单个核细胞悬浮于淋巴细胞分离液与血清之间,形成一薄层。

3.     用吸管吸出单个核细胞,加入另一试管中,尽量少吸淋巴细胞分离液,加入PBS(PH7.2-7.4)用吸管吹匀,室温250-350×g(900-1400rpm,r=15cm)离心10min,洗一遍,弃去上清。

4.     涂片:每管加入PBS约1 ml悬起细胞。用80ul 细胞悬液离心涂片一张(LTP-A,1000rpm,3 min),每份标本涂片3张(CD₃、CD₄、CD₈),用划圈笔在细胞斑周围涂圈。

五.T细胞亚群检测的操作

1． 固定：每片加固定液1滴加于圈内,室温固定5min,用PBS冲洗两遍,甩去水珠。必要时用3%过氧化氢甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶。

2． 按下表加I抗：轻轻摇晃,使单抗均匀铺在细胞表面于湿盒内室温孵育35min, PBS冲洗3遍

片别	抗体	加入量
CD3	CD3抗体工作液	10ul/片
CD4	CD4抗体工作液	10ul/片
CD8	CD8抗体工作液	10ul/片

3． 加生物素-II抗，每片加入10ul,室温孵育35min,PBS冲洗3遍。

4． 加链亲和素-辣根过氧化物酶复合物，每片加入10ul,室温孵育35min,PBS冲洗3遍。

5． 加底物显色液

底物显色液的配制:临用前10分钟配制。取1ml蒸馏水，加入1滴醋酸缓冲液和10ul AEC溶液混匀。

每片加入底物显色液20－50ul,室温孵育5～10min,镜下控制显色程度，用自来水冲洗终止。

6． 复染 加复染液1滴，染色15min,用自来水冲洗1遍。

7． 封片 用热水将封片剂融化后加1滴于片上,覆一盖玻片

8． 计数 高倍镜下数200-500个淋巴细胞中胞膜红染的细胞，计算CD₃T、CD₄T、和CD₈T阳性细胞的百分比，并计算CD₄T和CD₈T细胞的比值。

六．正常人PBL中T细胞亚群正常值：   CD₃ T：73．7 ± 7.7%；   CD₄ T ：44．5 ± 6.2%

CD₈ T：26．9 ± 5.7%；   CD₄T/CD₈T：1．74 ± 0.54

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