特别提示:包括pUM19-T Vector TA克隆载体在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:pUM19-T Vector TA克隆载体
产品货号:SY0295
产品规格:1μg
pUM19-T载体是一种用于PCR产物克隆(TA Cloning)的专用载体。它是在线性化pUC19载体的基础上,在两侧的3’端添加碱基T而制成。经特殊工艺改造后,使其具有较高的克隆效率:
1)特殊的纯化方式使得超过99% 的pUM19载体两端都具有3’-T突出端,因此大的降低了载体自连率。
2)由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR 产物的3’端添加一个A,可与pUM19载体3’ 端的T互补连接,因此可大大提高PCR 产物的连接和克隆效率。
3)pUM19载体多克隆位点位于β-lactamase基因内,可以通过蓝白斑快速筛选含有插入片断的重组子。
产品组份:
pUM19-T Vector (50 ng/μl)————20 μl
500 bp co
ntrol insert (50 ng/μl)————20 μl
使用说明
1. 将载体置于冰上融化。建议次使用时将载体分装成小份保存,每次取一支使用。
2. 按下表配制连接反应体系:
ddH2O
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To 10 μl
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10×Ligase Buffer
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1 μl
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pUM19-T Vector (50 ng/μl)
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1μl (约0.025 pmol)
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插入片段*
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0.075 pmol~0.25 pmol
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T4 DNA Ligase (400 U/μl)
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1 μl
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注:插入片段与载体的摩尔比应在3:1~10:1之间。请根据琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测确定插入片段的浓度,并根据其大小计算摩尔量。1 pmol 1 kb双链DNA的质量约为660 ng。
3. 对照反应体系(可选):
ddH2O
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6 μl
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10×Ligase Buffer
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1 μl
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pUM19-T Vector (50 ng/μl)
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1 μl (约0.025 pmol)
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500 bp control insert(50 ng/μl)
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1 μl (约0.15 pmol)
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T4 DNA Ligase (400 U/μl)
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1 μl
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4. 轻轻吹打混匀反应体系,室温22-26℃孵育1-2小时,或16℃过夜。
5. 转化:
1) 将连接产物加入到100 μl感受态细胞中(连接产物的体积不要超过感受态细胞体积的1/6),轻轻弹匀,冰上孵育30分钟。
2) 将离心管置于42℃水浴,不要晃动,准确热激90s后,立刻置于冰水浴中,不要晃动,静置2-3分钟。
3) 向离心管中加入900 μl LB或SOC培养基,150 rpm, 37℃振荡培养45分钟,使菌体复苏,抗性基因表达。
4) 2500 g离心5分钟,去掉900 μl上清。用剩余培养基将菌体重悬混匀,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀,室温正置10min。待菌液被平板吸收后,37℃倒置培养过夜。
【注】:如果使用超级感受态细胞(转化效率>108 cfu/μg),可以直接吸取100-200 μl孵育后的菌液涂板。剩余菌液可在4℃保存,一周之内都可重新涂板。
注意事项
1) 尽量避免反复冻融,可将载体和对照片段分装成小份后保存。
2) 连接使用的PCR 片段3’ 端应带有A 末端;Pfu DNA Polymerase (SY0036)等高保真聚合酶的扩增产物不带A,应先在其末端加A后再进行TA克隆。
3) 为了您的健康,实验操作时请穿实验服和带一次性手套。
附1:pUM19-T 载体结构
储存条件:-20℃。
根据您的关注的
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货号
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名称
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规格
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BTN90407B
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pression/BTN90407B.html" target="_blank">λDNA(不含N6-甲基腺嘌呤)
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5μg
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BTN81221
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pression/BTN81221.html" target="_blank">大肠杆菌HB101化学感受态细胞
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0.1mL*10
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BTN140376
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pression/BTN140376.html" target="_blank">大肠杆菌XL2-Blue感受态细胞
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10*100μl
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BTN80910
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pression/BTN80910.html" target="_blank">X-gal溶液
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10mL
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BTN120681
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pression/BTN120681.html" target="_blank">两性霉素B
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1mL
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BTN120695
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pression/BTN120695.html" target="_blank">新生霉素溶液
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5mL
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YT002
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pression/YT002.html" target="_blank">质粒中量抽提试剂盒
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50次
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关注
pUM19-T Vector TA克隆载体,pUM19-T Vector TA克隆载体,SY0295,百奥莱博,,的同时,为您推荐更多您可能感兴趣的产品:
名称:即用型蓝白T载体E型(无RNA启动子,无MCS)
货号:BTN120515
规格:20次
本产品是用Xcm I酶切线性化的DNA片段,其两个末端的5′都有一个突出的T,可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。
产品特点:
1. 由于是通过酶切制备,所以载体两端的带T率为,远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上,缩短了筛选过程。
3. 来源于pUC19 ,无RNA聚合酶启动子,插入位点两侧无多克隆位点。
4.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
5. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α 肽编码区内,可以进行蓝白斑筛选。
6.含有丝状噬菌体f1 复制起始子,可以制备单链DNA。
产品组成:
组分
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规格
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即用型蓝白T载体E型(10ng/μL)
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60μl
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阳性对照(35ng/μl)
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30μl
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储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期两年。
质粒图谱
名称:农杆菌EHA105化学感受态细胞
货号:BTN140383
规格:10×100μL
本产品为EHA105农杆菌化学感受态细胞,为C58型背景,核基因中含有筛选标签-利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA 插入植物基因组必需的元件,pEHA105(pTiBo542DTDNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。本产品适用于水稻、烟草等植物的转基因操作,经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达103cfu/μg。
储存条件:干冰运输、-80℃保存,有效期一年。
自备试剂:质粒DNA、液氮等
使用方法:
转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下,向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒,每100μL感受态细胞加1ug(体积不大于10μl)质粒DNA,轻柔混匀。冰水浴中静置5分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻5分钟(注:也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟,不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基,28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏,表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌,保留100μl左右上清,轻轻吹打重悬菌体,均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上,待平板中的液体完全吸收后,倒置平板,28-30℃培养48-72小时。
注:当平板只含有50μg/mL kan时,28℃培养48 h 即可;平板中同时加入50μg/mL kan、20μg/mL rif时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要28℃培养72-90h。
注意事项:
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少zuì终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25μg/mL,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50μg/mL kan,若所用平板含有20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失,但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素,Ti质粒丢失的概率低(可以忽略)。
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