BTN90805 即用型PCR试剂盒(含染料)

北京百奥莱博供应的即用型PCR试剂盒(含染料)用于生化实验研究等领域，即用型PCR试剂盒(含染料)是我司众多优质核酸扩增(PCR)之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。

北京百奥莱博科技有限公司是一家专业的生物试剂销售公司。公司主要经营血清、抗原、抗体等生物试剂产品，可以为您提供专业的技术服务，以优良的价格、优质的服务、优先的理念，满足客户的各方面的需求，与国内多家企业、单位建立了良好的长期合作关系，拥有较好的企业信誉和品牌形象。 主营产品:血清、抗体、抗原、核酸提取、核酸纯化等生化试剂

特别提示：包括即用型PCR试剂盒(含染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：即用型PCR试剂盒(含染料)
英文名称：Instant PCR MasterMix
产品货号：BTN90805
产品规格：1ml×10|5mL×20

本产品内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应，具有广泛的用途。

产品特点：
1.扩增效率和灵敏度更高。
2. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。
3.快捷，操作步骤已经zuì大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
4.产物可直接用于T载体克隆，不需要额外的加A反应。
5.染料单独提供，方便客户组合。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：(以30μL的标准PCR反应体系为例)
在一干净的PCR管中，加入下列成分：

试剂		加入量
PCR MagicMix		15μl
DNA模板(自备)	哺乳动物基因组DNA	0.5-1μg
	酵母基因组DNA	5-500ng
	细菌基因组DNA	0.5-50ng
	质粒DNA	5-500pg
	PCR回收片段	1-100pg
PCR引物(自备)		10pmol each
补水到		30μL

放入PCR仪中进行PCR,结束后取5-10μL直接上样电泳，按照1.0mL PCR MagicMix加入40μL专用染料的比例将40μL专用染料加入到1mL PCR MagicMix中
注意：
1．如果反应体系不是30μL，各成分需要等按比例增加或减少。
2．如果DNA模板中有PCR不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物)，可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物清除剂(BTN60804，30μL体系中加3uL)，可能会对PCR有帮助。

PCR反应的影响因素
变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，zuì高变性温度不宜超过95℃。
退火温度与时间：退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的zuì适退火温度，可根据引物的(G+C)%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30~60秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。
延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数：可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
酶量：50μl反应体系可用0.5-5 U酶，酶量的选择与模板DNA的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。
模板：模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1μg为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。
引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，zuì高不宜超过30个核苷酸，zuì佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5′端多加几个碱基，有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3′端。如果可能，引物3′端zuì好富有GC，这样退火后有利于引物3′端的延伸。人工合成的引物zuì好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2μm左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。

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货号	名称	规格
BTN131176	石蜡包埋组织直接RT-PCR试剂盒(免RNA提取)	30次
BTN130506	PCR级海藻糖溶液	1.5mL
BTN60901	可逆型Taq DNA聚合酶抑制剂	0.3mL
BTN101005	即用型易错PCR试剂盒	100次
BTN70906	NTP溶液(10mM)	0.5mL
WE0127	全血Taq DNA聚合酶	2500U

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名称：DMSO，PCR级
货号：BTN80205
规格：1.5mL
大量实验显示5-10%的DMSO能够促进PCR反应，尤其是高GC模板的PCR反应，本产品就是专门用于PCR或RT-PCR的高纯度DMSO。

储存条件：常温运输及保存，有效期一年。

名称：硫酸镁溶液(PCR级MgSO4溶液)
货号：BTN130840
规格：5mL
本产品为专门用于PCR的MgSO4溶液，浓度10mM，可以用于调节MgSO4的zuì佳浓度。MgSO4为常用的PCR增强剂之一。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

名称：10nt随机引物(0.5μg/uL)
货号：BTN131227
规格：250
本产品为长度为10nt的随机引物，序列为5′-(NNNNNNNNNN)-3′，主要用于cDNA的合成和DNA探针标计。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

疑难解答：
Q: 随机引物的长度对cDNA合成有何影响？
A: 文献报道，长度为10个nt的随机引物合成cDNA的效果好于6nt长的随机引物。

名称：Oligo dT12-18引物(0.5μg/μL)
货号：BTN100814
规格：5μg
Oligo(dT)12-18为长度在12到18之间的Oligo(dT)混合物，可以用于以带polyA尾巴的RNA为模板的链cDNA合成。建议每20μL反应体系使用0.5μg oligo(dT)。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

名称：双酶一管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)
货号：BTN91202
规格：50次
本产品是经过精心优化的、基于MMLV 逆转录酶和Taq DNA聚合酶的双酶一管式RT-PCR试剂盒，它含有除模版RNA和其专一性引物以外的所有RT-PCR试剂，包括MMLV 逆转录酶、Taq DNA聚合酶、RT-PCR缓冲液等，可以在同一反应管内完成RNA→cDNA→PCR反应(RT-PCR反应)。

产品特点：
1.一管式完成RT-PCR反应，避免样品交叉污染。
2. 即开即用，用户不需要单独准备RT-PCR所需的各种试剂。
3. 主要成分只有两个RT-PCR buffer和MMLV-Taq Mix，将加样步骤减少到zuì低，大降低了加样误差，增加了可重复性。
4. 使用范围广，适用于从病毒RNA 到人RNA的各种RNA 模板。
5.高灵敏度，每个RT-PCR 体系zuì低可以检测200拷贝的RNA分子，可扩增的模版RNA的zuì长达2000nt。
6. 所得RT-PCR产物可以直接用于AT克隆。

试剂盒组成：

成分	规格
双酶一管式RT-PCR Buffer(2×)	750μl
MMLV-Taq Mix	100μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
注意：所有离心管用前zuì好全部短暂离心几秒使管壁上溶液沉淀到管底。下面以一个30μL 体系的RT-PCR 为例，如果体积不同，各成分用量需要适当调节。
1.在一干净的无RNase的PCR管中，先加入下列成分：

成分	阴性对照	样品
RNA模板(自备，分下面三种情况)	无	见下
总RNA	无	100-500ng
或poly(A)mRNA	无	10-500ng
或体外转录得到的专一RNA	无	0.01 pg-500ng
RNA特异性引物一(自备)	终浓度300nM	终浓度300nM
RNA特异性引物二(自备)	终浓度300nM	终浓度300nM
探针(仅对Realtime RT-PCR)	终浓度200nM	终浓度200nM
RNase-free水	补到13μL	补到13μL
双酶一管式RT-PCR Buffer(2×)	15μl	15μl
MMLV-Taq Mix	2μl	2μl

注：通常初次使用本试剂时，可用引物浓度300nM，探针浓度200nM进行实验，根据实验结果具体情况，在200～800nM 范围内调整引物浓度，在50～400nM 范围内调整探针浓度以达到zuì佳检测效果。引物、探针、待检样品的具体加量用户可以根据实际情况调整，同时增减DEPC 水用量，保证总反应体积不变即可。
2. 轻柔混合均匀后放入PCR 仪中进行RT-PCR。
3. 设定RT-PCR反应条件时，一般将RT的条件设定成42℃，30 钟，后接94℃变性5分钟，然后进入PCR循环(PCR参数将根据自备引物的Tm 值由用户自行决定注)、zuì后72℃，5分钟。对Realtime PCR，在复性步骤设置荧光检测，检测通道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
4. RT-PCR结束后取5-10μL电泳检查。

注意事项：
1. 使用已校准的移液器，选用一次性PCR反应管、离心管、tip 头等进行样本处理及配液等操作，所有用具应不含DNA酶和RNA酶。
2.引物、探针设计过程中应尽可能避免发夹结构、二聚体等现象的发生，探针的位置尽可能靠近上游引物，PCR 目标片段zuì好小于200bp，尽可能在150bp以内。
3. 实验样品尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA 降解。
4. 使用本产品时建议对RT-PCR扩增条件、引物浓度和样品用量进行调整，选择zuì适当的引物浓度、样品浓度和PCR扩增条件。
5. 本产品使用前应在室温充分融解，并用漩涡震荡器充分混匀。
6. 统一配液后分装以减少加样误差，每次实验应设置阴性对照。
7. 禁止标记PCR反应管，避免外源性荧光信号干扰。
8. PCR反应管中不能有气泡，否则会产生非特异的荧光信号。若有气泡，可先用手指将气泡弹破，然后再低速离心消除。
9. 实时荧光PCR 仪器连续进行实验时，zuì好间隔一小时以上再使用。
10. 实时荧光PCR 仪需经常校正和清洁载样板板孔。
11. 若使用Roch LightCyclerTM荧光PCR 仪，应将毛细管放在专门套管中，以便分装反应体系和加入待检样品。前述操作完毕应低速离心数秒再将毛细管垂直缓慢放入样品架，以免折断；若发生折断，应小心取出，用专用小毛刷擦拭干净后方可进行扩增。
12. 实验室应严格分区，避免PCR产物污染。

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