特别提示:包括植物核蛋白提取试剂盒在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:植物核蛋白提取试剂盒
英文名称:Plant nuclear protein extraction kit
产品货号:HR0103
产品规格:50T|100T
植物核蛋白提取试剂盒提供全套试剂,适用于从各种植物细胞和各种实体植物组织,如叶片、根、种子等植物组织中提取核蛋白。提取过程简单方便,可在1小时内完成。制备的核蛋白不仅纯度高,保持天然活性,而且少交叉污染。提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解植物核组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物,阻止了蛋白酶对蛋白的降解,为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
本试剂盒中不含有EDTA,与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分,不可直接用于2D电泳,如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳,请使用我司其他货号的试剂盒。也可以将zuì后样品除盐后再用于2D电泳,用脱盐柱脱盐处理(货号HR0389)。
储存条件:蛋白提取液2-8℃保存;蛋白酶抑制剂-20℃保存。提取液A长期不用请置-20℃保存。
有效期:一年。
使用前请仔细阅读产品说明书
使用限制:本试剂盒仅供科学研究使用,不可用于诊断或治疗。
产品更新:我司会更新或升级产品,以优化和增强其使用性能,产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时,请参照随产品附带的说明书,不要参照网上下载的说明书,可能是不同的版本。
使用安全: 使用时需要合适的实验室外套,一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛,应立即用水冲洗。
产品特点:
1.使用方便。
2.含蛋白稳定剂,提取的蛋白稳定。
3.紫外检测蛋白浓度时,背景干扰低。
4.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64,每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
试剂盒以外自备试剂耗材和仪器
● PBS ● 吸头、离心管 ● 移液器 ●冰盒 ● 匀浆机/器 ●离心机 ● 涡旋振荡器 ●冰箱
使用方法:
使用注意事项:
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
●蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
●可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
1.提取液制备:
每200μl提取液C中加入2μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
【注】:
① 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
② 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完,再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
2.取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的200-500mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎,加入1-2ml PBS后用匀浆机充分匀浆或者加适量PBS后用Dounce匀浆器充分匀浆。
3.将匀浆用250 目细胞筛过滤;
或者在4℃,100g 力条件下离心1分钟,收集上清,弃沉淀。
4.将滤液在2000g条件下离心5-10分钟,收集沉淀。
5.在沉淀中加入500μl提取液A,充分混匀。
【注】:
●培养细胞1000g条件下离心5分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞后用PBS洗涤2次,然后直接加入提取液A重悬。
● 大约每300μl细胞压积中加入1ml 提取液A。
6.将细胞悬液置振荡器上37℃或室温振荡1-3小时。
【注】:
● 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。
● 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至12小时以上过夜处理以提高核蛋白得率。
7.在2000g条件下离心5-10分钟,弃上清,收集沉淀。
8.在沉淀中加入1ml 提取液B,充分混匀。
9.置振荡器振荡30分钟。
10.在2000g条件下离心5-10分钟,弃上清,收集沉淀。
11.在沉淀中加入100-200μl冷的提取液C,高速涡旋振荡5秒。
12.置4℃振荡30-40分钟,至无明显沉淀。
【注】:
● 没有持续振荡条件,也可静置,中间每隔几分钟充分混匀。
13.在4℃,16000g条件下离心10分钟。
14.将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到核蛋白。
15.将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】:
● 建议用BCA 法进行蛋白定量。相关产品:HR0329。
●蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉,不要被细菌污染。
常见问题分析:
●蛋白浓度低?
植物核蛋白丰度比较低,在条件允许的情况下,尽可能增加样本量。
处理部分样本时可能没有裂解完全,导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂A的匀浆次数,并适当延长试剂A和B的处理时间即可。zuì好在持续振荡的条件下处理,没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
●用什么方法定量蛋白?
建议用BCA 法。不适合用Bradford 法,因为试剂A中含有干扰Bradford 法的组份,导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系,则可以用Bradford 法定量。
● 提取时出现胶状沉淀?
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA 结合特别紧密的特定蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验即可;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理,300w/10秒间隔10秒,超声3分钟,随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,
不必进行超声处理。
● 提取的蛋白具有活性吗?
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份,不破坏蛋白的结构,没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏,蛋白均保持其天然构象和活性。
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名称:SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
货号:WE0293
规格:40-60 gels|200-300 gels
本试剂盒包括SDS-PAGE凝胶制备所需全套试剂,只需自备蒸馏水,即可制备高质量各种浓度的变性PAGE凝胶,方便、快捷。本试剂盒在分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液中已加入10%SDS,使用时不用另外加入。
试剂盒组成:
组份
|
40-60 gels
|
200-300 gels
|
30%Acr-Bis(29:1)
|
100ml
|
2×250ml
|
SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)
|
100ml
|
500ml
|
SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×)
|
50ml
|
250ml
|
APS
|
0.5 g
|
2.5 g
|
TEMED
|
1ml
|
5 m l
|
本产品所提供的APS(过硫酸铵)为固体粉末,使用前加入纯水溶解即配制成10%APS溶液(0.5 g APS加5ml纯水、2.5 g APS加25ml纯水),将溶液分装后置于-20℃保存,通常半年内有效。溶液在使用中可放置4℃保存两周。
注意事项:
1、10%APS配制后分装-20度保存。APS溶液不稳定,应尽量减少室温存放时间,每次取用后立即放回冰箱,以防失效;若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10%APS。
2、PAGE凝胶的凝聚速度与温度以及APS、TEMED的用量密切相关;在其它条件不变的情况下,可通过改变APS及TEMED的用量,控制PAGE凝胶的聚合速度,凝胶聚合过快不利于操作;附表中的APS及TEMED量可供参考,应根据实际操作情况做适当的调整。
3、在凝胶配制过程中,尤其是液体混匀步骤,应尽量避免气泡的产生。
4、在分离胶上层加纯水时要小心操作,加水时速度不能太快。
5、丙烯酰胺具有神经毒性,操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
6、本产品仅用于科研,不能用于人体实验或人体治疗。
操作步骤:
根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度,zuì佳胶浓度请参考附表1。
I 灌制分离胶(各试剂使用量请参考附表2)
1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
注:加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触,是否加入上层筛板可根据实际情况选择。
2.将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。
3.加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
4.在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可), 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层,使凝胶表面保持平整。
5.静置30-60分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,表面凝胶已聚合。
II 灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表3)
1、去除覆盖在分离胶上的水层。
2、将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。
3、加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
4、将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
5、将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
6、静置10~20分钟,等待浓缩胶聚合。
7、待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。
8、进行常规电泳操作。
附表1. SDS-PAGE分离胶的浓度与zuì佳分离范围
SDS-PAGE 分离胶浓度
|
zuì佳分离范围
|
6%胶
|
50-150 kD
|
8%胶
|
30-90 kD
|
10%胶
|
20-80 kD
|
12%胶
|
12-60 kD
|
15%胶
|
10-40 kD
|
附表2. 配制SDS-PAGE分离胶
分离胶浓度
|
凝胶体积
|
所需各组分体积(单位:ml)
|
纯水
|
30%Acr-Bis(29:1)
|
SDS-PAGE Separating
Gel Buffer(4×)
|
10%APS
|
TEMED
|
6%
|
5ml
|
2.75
|
1.0
|
1.25
|
0.05
|
0.004
|
10ml
|
5.5
|
2.0
|
2.5
|
0.1
|
0.008
|
15ml
|
8.25
|
3.0
|
3.75
|
0.15
|
0.012
|
20ml
|
11
|
4.0
|
5
|
0.2
|
0.016
|
8%
|
5ml
|
2.42
|
1.33
|
1.25
|
0.05
|
0.003
|
10ml
|
4.8
|
2.7
|
2.5
|
0.1
|
0.006
|
15ml
|
7.25
|
4.0
|
3.75
|
0.15
|
0.009
|
20ml
|
9.7
|
5.3
|
5
|
0.2
|
0.012
|
10%
|
5ml
|
2.08
|
1.67
|
1.25
|
0.05
|
0.002
|
10ml
|
4.17
|
3.33
|
2.5
|
0.1
|
0.004
|
15ml
|
6.25
|
5.0
|
3.75
|
0.15
|
0.006
|
20ml
|
8.3
|
6.7
|
5
|
0.2
|
0.008
|
12%
|
5ml
|
1.75
|
2.0
|
1.25
|
0.05
|
0.002
|
10ml
|
3.5
|
4.0
|
2.5
|
0.1
|
0.004
|
15ml
|
5.25
|
6.0
|
3.75
|
0.15
|
0.006
|
20ml
|
7.0
|
8.0
|
5
|
0.2
|
0.008
|
15%
|
5ml
|
1.25
|
2.5
|
1.25
|
0.05
|
0.002
|
10ml
|
2.5
|
5.0
|
2.5
|
0.1
|
0.004
|
15ml
|
3.75
|
7.5
|
3.75
|
0.15
|
0.006
|
20ml
|
5
|
10.0
|
5
|
0.2
|
0.008
|
附表3. 配制5%SDS-PAGE浓缩胶
凝胶体积
|
所需各组分体积(单位:ml)
|
纯水
|
30%Acr-Bis(29:1)
|
SDS-PAGE Stacking
Gel Buffer(4×)
|
10%APS
|
TEMED
|
2ml
|
1.14
|
0.34
|
0.5
|
0.02
|
0.002
|
4ml
|
2.28
|
0.68
|
1
|
0.04
|
0.004
|
6ml
|
3.42
|
1.02
|
1.5
|
0.06
|
0.006
|
8ml
|
4.56
|
1.36
|
2
|
0.08
|
0.008
|
储存条件:2~8℃
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