特别提示:包括2×即用型PCR预混溶液(热启动高保真)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:2×即用型PCR预混溶液(热启动高保真)
英文名称:2×HotStart Pfu Master Mix
产品货号:SY0039
产品规格:1ml
包含HotStart Pfu DNA Polymerase,dNTP以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增,大大简化实验的操作步骤,提高了高通量操作和实验结果的重现性。体系中含有的保护剂使得Master Mix 经过反复冻融后仍可维持稳定的活性。PCR产物为平末端。
质量控制
核酸外切酶残留检测:20 μl本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测:20 μl本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中,以ddH2O为模板,扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,无扩增条带。
功能检测1:以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2:以10 ng λDNA为模板扩增30个循环,取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的15 kb条带。
储存条件:-20℃。
根据您的关注的
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名称:可逆型Taq DNA聚合酶抑制剂
货号:BTN60901
规格:0.3mL
Taq DNA聚合酶是进行PCR的zuì常用工具酶,但是由于它在常温下还是具有部分活性,所以经常会出现非特异的扩增产物,尤其是当PCR反应体系中有大量非特异DNA存在的时候。目前zuì常见的解决方法是使用抗Taq DNA聚合酶的抗体和使用经过化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶(如AmpliTaq Gold),但前者的缺点是加热后抗体会不可逆失活,后者的缺点是需要预热处理使酶激活。
产品特点:
1.可逆抑制Taq DNA聚合酶的活性,即常温抑制Taq酶活性,在45℃以上抑制功能丧失,当温度降低到45℃以下后,抑制活性又得以恢复。
2. 耐热,产品本身为非蛋白质试剂,远比Anti-Taq抗体稳定,便于保存和运输。
3. 使用简单,在加Taq酶前将本产品按PCR反应体积的1/10直接加入即可。
4.适用范围广,除Taq DNA聚合酶外,还可用于抑制其他DNA聚合酶的活性,如:Tth pol、Stoffel片段、Tfl pol、Tbr pol等。而一种酶的抗体一般对另一种酶的活性没有抑制作用。
5.与后续的RT-PCR兼容。
储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法:
在加入Taq或Tth DNA聚合酶之前,按PCR反应终体积1/10的比例将本产品加入到反应体系中混匀,然后再加入DNA聚合酶,启动PCR反应。
名称:可调式易错PCR试剂盒
货号:BTN160903
规格:100次
易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错PCR和常规PCR的比较如下:
产品特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,实验人员在一定范围内可以控制突变率,一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp,更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3.可用于连续易错PCR,只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4.可以扩增的DNA片段更长,达到3kb,对于3kb以上的产物,建议分段扩增。
试剂盒组成:
成分
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规格
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Taq DNA聚合酶(5U/μL)
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100μl
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易错PCR专用dNTP 2.0,10×
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300μl
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易错PCR Mix 2.0,10×
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300μl
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易错PCR专用MnCl2
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300μl
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易错PCR专用dGTP
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300μl
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超纯水
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1ml
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储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期为一年。
使用方法:
1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。
注意:引物是决定易错PCR成败的关键因素,设计引物时要保证其Tm在70℃,长度在25-30nt之间,GC含量在45%-60%之间,3端GC含量低,并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2,B表示易错PCR专用的dGTP:
预期突变数
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2个
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3个
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4个
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5个
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6个
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7个
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8个
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A的用量(μl)
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0
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1.0
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2.5
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4.0
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4.0
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4.0
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4.0
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B的用量(μl)
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0
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0
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0
|
1.0
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2.0
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3.0
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4.0
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3.以30μL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30μL,各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中,加入下列成分
注意:可以先计算出超纯水的用量,优先加水
成分
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用量
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超纯水
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根据第2步加
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易错PCR Mix,10×
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3μl
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易错PCR 专用dNTP,10×
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3μl
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易错PCR 专用MnCl2
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根据上步
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易错PCR 专用dGTP
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根据上步
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自备DNA模板(1ng/μl)
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1μl
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自备PCR引物(10μM each)
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1μl each
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Taq DNA聚合酶(5U/μl)
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1μl
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4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件,一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言):
PCR前变性
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94℃ 3分钟
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易错PCR(循环30次)
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94℃ 1分钟
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45℃ 1分钟
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72℃ 1分钟
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注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增
加1Kb,时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能的突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
5.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板,进行下一轮的易错PCR。
疑难解答:
Q:现象:没有PCR产物。
A:可能原因:一是引物没有优化,可以重新设计引物;二是模板DNA太少,可以增加用量;三是模板不纯,zuì好先胶回收;四是溶解DNA的溶液中有EDTA,降低了PCR反应体系的Mg离子浓度,可以适当补加Mg离子。
Q:现象:太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A:可能原因:一是PCR循环数太多;二是复性温度太低;三是延伸时间太长;四是引物没有优化,可以重新设计引物;五是PCR条件没优化,可以使用touch-down PCR;六是模板有其他DNA污染;七是DNA模板质量不高或者浓度太高。
Q:如果需要更高的突变率,如何办?
A:可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板,否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板,但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
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