1 收到细胞后先观察T-25瓶是否有损坏、漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2 对于贴壁细胞，若细胞漂浮：培养瓶不开封，用75%酒精擦拭后平躺置于培养箱内。次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以去掉；如细胞还不贴壁，将细胞离心收集移到新的培养瓶中，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

3 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和本公司技术部沟通交流。

我们全心全意为您服务，提供优质产品，保障售后服务，真心把客户奉为上帝，及时处理客户订单，全程跟踪货源，采用诚信快递运输，认真解答客户疑问，对客户售后问题，不拖沓，不推卸责任，认真负责的态度。素尔RS4 11 细胞

第二节 细胞分离技术

一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。

1、胰蛋白酶 (Trypsin)

在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。

将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。

在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。

移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。素尔RS4 11 细胞

2、胶原酶 (Collagenase)

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。

在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl₂增加解离效率。

通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

3、Dispase

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在37℃孵育20分钟到几个小时。

通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

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TE-10细胞，人食管癌细胞

TE-11细胞，人食管癌细胞

TE-13 细胞，人食管癌细胞

NEC细胞，人食管癌细胞

RB细胞，人视网膜母瘤细胞

 HTB-169细胞，人视网膜神经胶质瘤细胞

WERI-Rb-1细胞，人视网膜神经胶质瘤细胞

THP-1细胞，人髓系白血病单核细胞

JeKo-1细胞，人套淋巴瘤细胞

KU812细胞，人外周血嗜碱性白血病细胞

AGS细胞，人胃癌细胞

AZ-521细胞，人胃癌细胞

BGC-823细胞，人胃癌细胞

BGC-823-EGFP-puro细胞，人胃癌细胞

GC-7901细胞，人胃癌细胞

Hs-746T细胞，人胃癌细胞

KATO III细胞，人胃癌细胞

MGC803细胞，人胃癌细胞

MKN-45细胞，人胃癌细胞

NCI-N87细胞，人胃癌细胞

NUGC-3细胞，人胃癌细胞

SGC-7901*细胞，人胃癌细胞

SNU-1细胞，人胃癌细胞

SNU-5细胞，人胃癌细胞

SNU-638细胞，人胃癌细胞

HGC-27细胞，人胃癌（未分化）细胞

MKN-28细胞，人胃癌高转移细胞

GIST-T1细胞，人胃肠间质瘤细胞

SGC7901细胞，人胃腺癌细胞

HT-1080细胞，人纤维肉瘤细胞

Acc-2细胞，人涎腺腺样囊性癌细胞

二、从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。再次培养时检测细胞的活性。细胞的活率应该超过90％对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。

1、移弃使用过的细胞培养基。

2、使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

3、以2～3ml/25cm²的量，加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在5到15分钟内，细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

4、当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

5、对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性

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