BTN60904 一站式RNA电泳套装说明书

一站式RNA电泳套装说明书

产品编号：BTN60904

规格：10T

产品及特点：

本产品是包括琼脂糖、去离子甲醛、RNA 上样液、电泳液等在内的RNA电泳套装，专门用于RNA 电泳分析。可以进行至少10次mini 变性胶电泳。

1. 即开即用，用户不需要自己进行RNase 灭活、高压灭菌、pH 调节等操作。

2. 与 Northern杂交等后续反应兼容。。

规格及成分：

保存条件：

常温运输和保存，但收到货后RNAon 需要4℃保存，RNARUN，10×一旦打开需要-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：

EB (10 mg/mL)、DEPC 水。

使用方法：

注意：所有器皿（三角瓶，电泳槽，枪头等）均需去除RNase。强烈推荐使用本公司的的固相RNase 清除剂。

一、配制琼脂糖甲醛变性胶（1.2%, 100 mL）

1. 在三角瓶中加入下列成份:

琼脂糖 1.2-1.5g

DEPC水 87mL

2. 将琼脂糖加热融化后，加入10 mL 10×RNArun（10×RNArun 就是10×MOPS 缓冲液，其瓶子一旦打开，就很容易产生污染细菌，细菌大量繁殖后会释放大量 RNase，所以剩下的10×RNArun zui好-20℃放置）。

3. 待胶冷却至 60°C 左右，再加下列成份:

甲醛 3.0 mL

自备EB(10mg/mL) 2-4μL

注意：由于本试剂盒提供的RNAon 中含EB，所以也可以不加EB，但效果较差。如果使用自备的其他染料，如SYBR Green I，则不能同时使用其他染料，包括含EB 的RNAon，用户需要另购不含EB 的RNAon）。

4. 混匀后倒胶, 凝固半小时后即可以使用。

二、配制电泳液

5. 将 RNArun 用DEPC 水稀释十倍后即成电泳液，所需要的体积根据使用的电泳槽决定。

三、变性RNA 样品

6. 在一干净的离心管中将5-10 uL RNA 和15 uL RNAon 混合，50-60℃保温10 分钟后冰浴5-10 分钟，直接上样。注意：每一泳道至多可分析30 μg RNA，通常用10-20 μg 总RNA 进行Northern 杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA 总量的0.1%以上）；如待测RNA 含量微，每个泳道需加0.5-3.0 μg poly(A)+ RNA。

四、电泳

7. 电泳时，将凝胶预电泳5 min（电压为5 V/cm）。随后加样品和分子量对照(如果有的话)，以3－4 V/cm 的电压电泳，直至染料迁移至胶下游的3/4 处。

8. 电泳结束后，在300 nm 紫外灯下拍照。

五、后续处理

9. 按标准方法进行Northern 杂交等后续处理。

使用效果：

 

图注: 用本产品电泳兔全血总RNA 效果图。10 uL 总RNA与15 uL RNAON 混合后在甲醛琼脂糖变性胶上电泳0.5小时，直接在紫外灯下观察并照相。

疑难解答：

Q：RNA 电泳为何zui好使用RNARUN，不要使用DNA 电泳液TAE 或TBE？

A：一是因为RNARUN 经过去RNase 处理，而一般实验室使用的TAE 或TBE都没有经过去RNase 处理，故有可能含RNase，使样品RNA 降解。即使要灭活TAE 或TBE 中的RNase 也十分麻烦，因为DEPC 不能处理含Tirs 的缓冲液；二是TEB 含有硼酸，硼酸是研究多羟基醇和糖的经典试剂，它能与RNA 中含多羟基的核糖反应生成糖硼酸络合物，故电泳时RNA 带型十分弥散。在一定浓度范围内，RNA 分子间还能通过硼酸形成分子间复合物，出现电泳时各种RNA 以一条带的形式出现的现象。所以RNA 电泳时要避免使用含硼酸的缓冲液。使用TAE 效果虽然比TBE 稍好，但文献报道（BioTechniques 2000, 28:414-415），它不能分离某些大小不同的RNA 分子。

Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA 吗？

A：不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象，初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加RNase 处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议zui好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA 变性。

使用百奥莱博优化的上样/变性/染色三用溶液RNAON 可以使RNA 在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE 或超快电泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE 缓冲液，因为TBE 中的硼酸能与RNA 的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA 污染，可以用RNase 处理RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA 污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除剂DNAErasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。

Q：为何我的植物RNA 样品有4-5 条带？

A：部分植物组织有叶绿体等质体，而叶绿体有核糖体，所以也有其rRNA。

叶绿体的rRNA 跟细胞浆里面核糖体的rRNA 大小不同，所以一般会多出两条带（共4 条rRNA 条带）。小的tRNA 和5S rRNA 有时可见，有时不可见，取决于回收效率。