人基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)酶联免疫检测
试剂盒使用说明书
使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于生物素双抗体夹心技术原理,来检测人基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)),只能用于研究用途,不得用于医学诊断。
用 途: 用于人血清、血浆及相关液体样本中基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)的测定。
工作原理
本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中人基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)的水平。向预先包被了人基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)单克隆抗体的酶标孔中加入基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3),温育;温育后,加入生物素标记的抗TIMP-3抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅与样品中人基质金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)的浓度呈正相关。
试剂盒组成
1
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标准品(48ng/ml)
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0.5ml
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7
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显色剂A液
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6ml
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2
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标准品稀释液
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3ml
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8
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显色剂B液
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6ml
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3
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酶标包被板
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12孔×8条
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9
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终止液
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6ml
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4
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链霉亲和素-HRP
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6ml
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10
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说明书
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1份
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5
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30倍浓缩洗涤液
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20ml
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11
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封板膜
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2张
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6
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生物素标记的抗- TIMP-3抗体
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1ml
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12
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密封袋
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1个
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需要而未提供的试剂和器材
1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 移液器及一次性吸头
4. 蒸馏水,
5. 一次性试管
6. 吸水纸
注意事项
1. 从2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
3. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
4. 为避免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
5. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
6. 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
标本要求
1.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
2.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
操作程序
1. 标准品的稀释:(本试剂盒提供原倍标准品一支,用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释):
24ng/ml
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(5号标准品)
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120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液
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12ng/ml
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(4号标准品)
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120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液
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6ng/ml
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(3号标准品)
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120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液
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3ng/ml
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(2号标准品)
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120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液
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1.5ng/ml
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(1号标准品)
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120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液
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2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3. 加样:1)空白孔:空白对照孔不加样品,生物素标记的抗TIMP-3抗体,链霉亲和素-HRP,只加显色剂A&B和终止液,其余各步操作相同;2)标准品孔:加入标准品50μl,链霉素-HRP50μl(标准品中已事先整合好生物素抗体,故不加);3)待测样品孔:加入样本40μl,然后各加入抗- TIMP-3抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl,盖上封板膜,轻轻振荡混匀,37℃温育60分钟。
4. 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复4次,拍干。
6. 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
7. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。
操作程序总结:
准备试剂,样品和标准品
加入准备好的样品和标准品,生物素标记二抗和酶标试剂,37℃反应60分钟
洗板5次,加入显色液A、B,37℃显色10分钟
加入终止液
10分钟之内读OD值
计算
检测范围:0.1ng/ml→40ng/ml。
规格: 96T/盒
保存: 2-8℃
有效期: 6个月(2-8℃)。