Lipofect脂质体转染试剂操作步骤

中文名称：Lipofect脂质体转染试剂
用途：适合于将核酸(DNA和RNA)转染入真核细胞。
注意事项：无菌溶液，是一种新型的阳离子脂质体转染试剂，具有低细胞毒性；对多种类型的细胞和培养板都具有高转染效率。
储存条件：4℃，12个月
产品规格：0.5mL|1mL|5×1mL

细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，脂质体(lipofectin+regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium+Chloride(DOTMA)和Dioleoyl+photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下蕞方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第1，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者蕞佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

一、脂质体(liposome)转染方法原理脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。

二、脂质体转染操作步骤
1、操作步骤[方法一]：
(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2)+转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg+DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。+(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。+(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。+注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。
(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：+①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。+②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。+③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。
(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL+DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，
(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。
(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：
(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。