细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒操作步骤

产品名称：细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒
规格：50T/100T
分类：蛋白提取
储存条件：4℃,12个月
注意事项：裂解细胞提取细胞核蛋白与细胞浆蛋白

一、试剂盒说明  
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。

操作步骤
Ⅰ实体组织蛋白的提取
1、组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS均浆后，静置5 min ，弃沉淀，小心吸取上清转移至另一离心管中；
2、上清4℃离心500×g，3 min，弃上清，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；
3、每20μL细胞压积中，加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂】，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min；
4、加入11μL冷Buffer B，大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；
5、再次大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4℃离心，16000×g,5min；
6、尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；
7、在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂)，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；
8、4℃离心，16000×g,,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
9、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80℃，避免反复冻融。

Ⅱ  培养细胞蛋白提取
1、取培养细胞5×106～1×107个/mL，4℃离心，500×g,3 min收集细胞，弃去培养液，用预冷的PBS洗涤两遍；
2、用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；
3、每20μL细胞压积中，加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂】，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min；
4、加入11μL冷Buffer B，大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；
5、再次大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4℃离心，16000×g,5min；
6、尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；
7、在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂)，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；
8、4℃离心，16000×g,,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
9、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80℃，避免反复冻融。

注意事项
1、所有的试剂及器具均需预冷后使用；
2、细胞的数量不应少于0.5×107个/mL；，     
3、以上各缓冲液的使用量是以20μL细胞压积为例