吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色试剂盒说明书

吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色试剂盒说明书

产品简介：
细胞凋亡（Apoptosis）的检测方法有形态学、生物化学、DNA 片段化检测方法以及TUNEL 等标记片段化 DNA 方法，但从细胞凋亡概念产生的历史及准确性方面考虑，使用显微镜进行的形态学观察也是很重要的。细胞死亡的检测可以通过荧光色素染色区分活细胞、 死细胞， 测定细胞代谢活性和形态学观察。这些方法都是利用细胞凋亡这种情况进行测定的，因而不一定反映实际情况。MTT 法是测定线粒体中特有酶的活性，反映细胞数目的变化，其结果与细胞死亡的数目未必完全一致。

吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料, 既可以标记 DNA，又可以标记RNA,属于异染性荧光染料，因此 AO 常用于细胞内 DNA 和 RNA 进行检测。AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为 AO与 DNA 的结合，其荧光发射峰为 530nm，激发后呈绿色荧光； 2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为 AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为 640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会 呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链 DNA 分子中显绿色，与 DNA 单链或 RNA 结合时发橙红色荧光。

溴化乙锭（Ethidium Bromide,EB）嵌合到双链 DNA 或 RNA 的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可透过活细胞膜，EB 不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。

产品组成：                                                   
试剂(A): AO solution                200ul              4℃ 避光
试剂(B): EB solution                200ul                RT
试剂(C): AO/EB Dilution Buffer       50ml              4℃ 避光
使用说明书 1 份

自备材料：
1、 荧光显微镜
2、 PBS
3、 细胞计数板
4、 载玻片、盖玻片

操作步骤（仅供参考） ：
1、收集细胞，用PBS清洗细胞1次，加入适量的PBS重悬细胞，计数并调节细胞浓度至（0.2~5）*106/ml。
2、 AO/EB 工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)， 按照试剂(A):试剂(B):试剂(C)=1:1:8 的比例稀释成 AO/EB 工作液。
3、 每25~50ul细胞悬液中加入AO/EB工作液2ul，混合均匀，孵育5-15min。
4、 取洁净载玻片，滴加上 5~10ul 细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。
5、 在荧光显微镜 B 域进行观察。

染色结果：显绿色荧光的为活细胞；显橙色荧光的为死细胞。

注意事项：
1、用能通过活细胞膜与 DNA 结合后发蓝色荧光的 Hoechst 33342 和只能通过死细胞与
DNA 结合后发红色荧光的 propidium iodide，PI)对细胞进行 双染的方法也比较常用。
2、 如有低温离心机进行离心效果佳。
3、 操作过程中应注意减少试剂(A)、试剂(B)暴露于强光下的时间。
4、 试剂(B)有一定毒性，请小心操作。
5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 6 个月有效。