植物花色苷含量检测试剂盒(微量法)操作步骤

植物花色苷含量检测试剂盒(微量法)

保质期:6个月有效

产品简介:
花色苷是一类可食用的易溶于水等溶剂的天然色素。花色苷使植物呈现多彩的颜色，本身具有多种保健作 用，因而在天然食用色素、保健品和医药行业都有着广阔的应用前景。
根据花色苷在不同pH下的结构性质测定花色苷含量，在pH为1时花色苷在530nm处有大吸收峰,而当pH为4.5 时，花色苷转变为无色查尔酮形式在530nm处无吸收峰，通过测定不同pH下的530nm和700nm处的吸光度值计算样本中花色苷的含量。

自备材料：
1、可见分光光度计/酶标仪、
2、离心机、
3、水浴锅、
4、可调式移液器、
5、微量玻璃比色皿/96孔板、
6、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤(仅供参考):
1.  可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，可见分光光度计蒸馏水调零。
2.  加样表：在96孔板中分别加入
试剂名称(μL）    测定管1    测定管2    
样本    20    20    
试剂一    180    -    
试剂二    -    180    
充分混匀后测定测定管 1 和测定管 2 分别在 530nm 和 700nm 处的吸光度，测定管 1 在 530nm 和 700nm 处的吸光值记为 A1、A1’，测定管 2 在 530nm 和 700nm 处的吸光值记为 A2、A2’，计算 ΔA=（A1-A1’）-（A2-A2’）。

花色苷含量计算
A、以微量玻璃比色皿计算：
按样本质量计算：
花色苷含量(μmol/g量）=[ΔA÷(ε×d)×103×F]×V提取÷W=0.037×ΔA×F÷W

按样本蛋白浓度计算
花色苷含量(μmol/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×103×F]×V提取÷(Cpr×V提取)=0.037×ΔA×F÷Cpr
F：稀释倍数，该反应体系下为10；d：比色皿光径，1cm；W：样本质量，g；ε：花色苷的摩尔消光系数，2.69×104mL/mmol/cm；V提取：提取液总体积，1mL；103：单位换算系数，1mmol=103μmol；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL（蛋白浓度需用PBS单独提取后自行测定）。

以96孔板计算：
按样本质量计算
花色苷含量(μmol/g 质量）=[ΔA÷(ε×d)×103 ×F] ×V提取÷W=0.062×ΔA× F÷W

按样本蛋白浓度计算
花色苷含量(μmol/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×103 ×F] ×V提取÷(Cpr×V提取)=0.062×ΔA×F÷Cpr
F：稀释倍数，该反应体系下为10；d：96孔板光径，0.6cm；W：样本质量，g；ε：花色苷的摩尔消光系数， 2.69×104mL/mmol/cm；V提取：提取液总体积，1mL；103：单位换算系数，1mmol=103μmol；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL（蛋白浓度需用PBS单独提取后自行测定） 。

实验实例：
取 0.1g葡萄皮加入1mL 提取液充分匀浆后转移到 EP管中，封口膜封口防止挥发，60℃浸提 30min，期间可 震荡数次，提取后提取液定容至1mL，离心取上清后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA=（A1-A1’）-（A2-A2’）=（0.573-0.060）-（0.120-0.060）=0.453，按样本质量计算含量得：
花色苷含量(μmol/g质量）=0.062×ΔA×F÷W =0.062×0.453×10÷0.1=2.81μmol/g质量。

注意事项:
1、 注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
2、 如果A1大于1，可以适当加大稀释倍数，保证总体积200μL不变，如10μL上清液和190μL试剂一（相当于稀释 20倍）；如果A1小于0.1，可以适当缩小稀释倍数，保证总体积不变，如100μL上清液和100μL试剂一（相当 于稀释2倍），使A1保持在0.1~1范围内，可提高检测灵敏度；注意应同样调整上清液和试剂二体积比例；计 算时以实际稀释倍数代入计算公式中。
3、 因提取液会使蛋白变性， 若使用蛋白浓度计算需用PBS单独提取后自行测定。