英文名称：Human IGFBP-1 ELISA Kit
规格：96T/48T
保存；2-8℃。
特异性：可检测样本中的人胰岛素样生长因子结合蛋白1，且与其类似物无明显交叉反应。
应用：用于人血清、血浆或其他相关生物液体中胰岛素样生长因子结合蛋白1的测定。
实验原理：
本试剂盒采用的是双抗体夹心法酶联免疫吸附检测技术（ELISA）。测定样品中人胰岛素样生长因子结合蛋白1水平。向预先包被了抗人胰岛素样生长因子结合蛋白1抗体的酶标孔中，加入标准品和样本，温育后，加入生物素标记的抗胰岛素样生长因子结合蛋白1抗体。再与HRP标记的链霉亲和素结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物TMB，产生蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。后，在450 nm处测定反应孔样品吸光度（OD）值，样本中的人胰岛素样生长因子结合蛋白1浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中人胰岛素样生长因子结合蛋白1的浓度。
基本参数：
检测指标：IGFBP-1；IGFBP1；IGF结合蛋白1
检测范围：31.2pg/ml～2000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜1pg/ml
产品组成：
组分 规格 数量
预包被抗人IGFBP-1抗体的96孔板 96T 1板
重组人IGFBP-1标准品(冻干) 10ng/管 2管
生物素标记抗人IGFBP-1(100X) 100μL 1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X) 100μL 1管
样品稀释液 30mL 1瓶
抗体稀释液 12mL 1瓶
ABC稀释液 12mL 1瓶
TMB显色液 10mL 1瓶
TMB终止液 10mL 1瓶
洗涤缓冲液(25X) 20mL 1瓶
封板膜 4张
保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。
自备器材：
1.标准规格酶标仪。
2.自动洗板机。
3.恒温箱
4.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，好用多通道移液器。
5.干净的试管和Eppendof管。
6.用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。
注意事项：
1.使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
2.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3.要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4.为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
5.禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6.远慕生物提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
7.揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
洗板方法：
1.手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
2.自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品准备：
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
1.血清：用干净试管收集血液，凝固2小时后离心1000×g 10分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2.血浆：采用EDTA或肝素抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 10分钟。立即分析或分装后20℃冷冻保存。
3.细胞培养上清、尿液：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
4.贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
5.悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释：
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
1.高：指待测因子在20～200ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
2.中：指待测因子在2～20ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
3.低：指待测因子在31.2～2000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
4.特低：指待测因子≤31.2pg/ml。样品一般不做稀释，或按1:2稀释。
试剂准备：
A.人IGFBP-1标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
1.配制10,000pg/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
2.配制2000pg/ml标准品：取0.2mL 10,000pg/ml的标准品加入有0.8mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
3.配制1000pg/ml～31.2pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上1000pg/ml,500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。取0.3mL 2000pg/ml的标准品加入标记1000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到后一只样品管。注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，但不得反复冻融。
B.生物素标记抗人IGFBP-1抗体工作液的准备：在使用前2小时内准备。
1.根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
2.按1μL生物素标记抗人IGFBP-1加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
C.亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1.根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
2.按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
操作步骤：
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
2.将2000pg/ml,1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆、细胞裂解液、尿液或细胞培养上清，每孔加100μL已用样品稀释液稀释的样品。
3.酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
5.将准备好的生物素抗人IGFBP-1抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
6.酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
7.1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
8.将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
9.酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
10.1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
11.按每孔90μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应25～30分钟。注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
12.按每孔100μL依次加入终止液，顺序同加TMB。此时蓝色立转黄色。
13.用酶标仪在450nm测定O.D.值。有两种设定空白对照的方案：
①将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
14.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
操作总结：
1.加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
2.加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
3.加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
4.TMB 37℃反应25～30分钟。
5.加入终止液，读数。
参考总结：
取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。
浓度(pg/ml) 0 31.2 62.5 125 250 500 1000 2000
OD值 0.052 0.140 0.225 0.386 0.701 1.134 1.941 2.626
可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！
