人Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)ELISA试剂盒操作步骤

实验原理：
将目标抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的目标连接于固相载体上的抗体结合，然后加入微生物化的目标抗体，将未结合的生物素抗体洗净后，加入HRP标记和亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

试剂盒组成：
试剂盒成份（2-8℃保存）    96孔配置    48孔配置    配制
96/48份酶标板    1块板（96T）    半块板（48T）    即用型
塑料膜板盖    1块    半块    即用型
标准品：400ng/ml    1瓶（0.6ml）    1瓶（0.3ml）    按说明书进行稀稀
空白对照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）    即用型
标准品稀释缓冲液    1瓶（5ml）    1瓶（2.5ml）    即用型
生物素标记的PⅢNT抗体    1瓶（6ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
亲和链酶素-HRP    1瓶（10ml）    1瓶（5.0ml）    即用型
洗涤缓冲液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）    按说明书进行稀释
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
终止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型

实验所需自备试验器材：
1. 酶标仪（450nm）
2. 加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
4. 蒸馏水或去离子水

操作注意事项
1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

试剂的准备
1．  标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
400ng/ml    （6号标准品）    原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
200ng/ml    （5号标准品）    100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
100ng/ml    （4号标准品）    100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
50ng/ml    （3号标准品）    100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
25ng/ml    （2号标准品）    100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
12.5ng/ml    （1号标准品）    100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0ng/ml    （空白对照）    原始浓度不用稀释直接加入50ul。

2．  洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

ELISA技术小提示：
1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。
2. 为了避免交叉感染，配置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽。
3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。
4. 混合后的显色底物在上板前应为无色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色变成不同深度的蓝色。
5. 终止液上板顺序应同显色底物上板顺序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。