人白介素1(IL-1)ELISA试剂盒操作步骤

产品名称：人白介素1(IL-1)ELISA试剂盒
英文名称：Human IL-1 ELISA KIT
使用目的：本试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中的指标含量。
注：本试剂仅供科研，不得用于临床！

实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中指标水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算浓度。

简介：
白介素1 (IL-1)是一种多肽，分子质量为17 ku，有 IL-1a 及 IL-1β 两种亚型。IL-1a 由159个氨基酸组成；IL-1β 含153个氨基酸；两者由不同的基因分别编码。虽其氨基酸顺序仅有26％的同源性，然而IL-1a 和IL-1β 以同样的亲和力结合于相同的细胞表面受体，发挥相同的生物学作用。IL-1受体（IL-1r）IL-1r几乎存在于所有有核细胞表面，每个细胞的IL-1r数目不等，少则几十个（如t细胞），多则数千个（如成纤维细胞）。IL-1r主要有两种类型：一种为IL-1r1，其分子伸入胞浆内的肽链部分较长，起着传递活化信号的作用；另一种为IL-1r2，胞内部分的肽段较短，不能有效地传递信号，而是将胞外部分的肽链释放到细胞外液中，以游离形式与IL-1结合，发挥反馈抑制作用。gm-csf、g-csf及IL-1自身均可提高细胞IL-1r的表达水平，而tgf及皮质类固醇能降低IL-1r的表达。

人白介素1(IL-1)ELISA试剂盒包括：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水；
（7）酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可在小试管中进行稀释。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果判定方法
1)目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照；与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。
2)以样品孔的OD值大于阴性对照OD值+2～3SD，作为阳性结果的阈值。
3)以P／N值(阳性孔OD值／阴性孔OD值)大于或等于2．1为阳性；P／N值小于2．1，但大于1．5为可疑；P／N小于1．5为阴性。
4)定量测定结果根据标准曲线计算样品中待测物的含量。