组织沉默调节蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒（中文版）
主要用途
组织沉默调节蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合成的乙酰化 p53 多肽底物，经过 SIRT1 脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实
验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中 SIRT1的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin
A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于细胞核内，与酵母Sir2同源性zui高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位点）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，先使用比色染料对硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，Z后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺（波长405nm），由此来定量测定沉默调节蛋白1的活性。其反应系统为：
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
分离液（Reagent B） 毫升
清理液（Reagent C） 毫升
萃取液（Reagent D） 毫升
缓冲液（Reagent E） 毫升
底物液（Reagent F） 微升
终止液（Reagent G） 微升
酶解液（Reagent H） 微升
补充液（Reagent I） 微升
产品说明书 1 份
保存方式
保存缓冲液（Reagent E）、底物液（Reagent F）、终止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在 4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证 6 月
用户自备2
磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗组织样品
15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
（微型）台式离心机：用于组织细胞预处理
培养箱：用于反应物孵育
酶标板或比色皿：用于反应和比色的容器
酶标仪或分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定 500 毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入 xx 毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗 1 次
4． 移入到一个液氮冻存管
5． 即刻放进液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（Z快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个 15 毫升锥形离心管
8． 加入 xx 毫升裂解液（Reagent A），混匀细胞
9． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管
10．强力涡旋震荡 10 秒
11．置于冰槽里孵育 15 分钟
12．加入 xx 毫升预冷的分离液（Reagent B），混匀
13．放进 4℃台式离心机离心 10 分钟，速度为 1300g
14．小心抽去上清液
15．加入 xx 毫升预冷的清理液（Reagent C）
16．放进 4℃台式离心机离心 10 分钟，速度为 1300g
17．小心抽去上清液
18．小心加入 xx 微升预冷的萃取液（Reagent D），混匀
19．转移到新的预冷的 1.5 毫升离心管
20．超声处理 30 秒
21．置于冰槽里孵育 30 分钟
22．放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 EPPENDORF 5415）
23．小心移取上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
24．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－JW30030.1）
25．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里3
2． 设定好酶标仪或分光光度仪（温度为 30℃）： 波长 405nm，并置零
3． 缓冲液（Reagent E）置于室温下均衡温度
三、活性测定
（一） 终点法活性测定
1． 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
2． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent E）到相应孔中
3． 分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）
4． 分别加入 xx 微升补充液（Reagent I）或待测样品（50 微克核蛋白或 200 微克组织裂解萃取液总蛋白）
（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒
6． 放进 30℃培养箱里，孵育 60 分钟，避免光照
7． 分别加入 xx 微升终止液（Reagent G）
8． 分别加入 xx 微升酶解液（Reagent H）
9． 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒
10．在 30℃培养箱里，孵育 30 分钟
11．即刻放进酶标仪或转移到 100 微升比色皿，在分光光度仪里检测：获得吸光读数
12．活性计算：
（1） 酶标仪检测
（2） 比色皿检测
（二） 酶动法活性测定
1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
2． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent E）到相应孔中
3． 分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）
4． 分别加入 xx 微升补充液（Reagent I）或待测样品（50 微克核蛋白或 200 微克组织裂解萃取液总蛋白）
（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动 96 孔酶标板 30 秒
6． 放进 30℃培养箱里，孵育 2 分钟，避免光照
7． 分别加入 xx 微升酶解液（Reagent H）
8． 轻轻摇动 96 孔酶标板 5 秒
9． 即刻放进酶标仪或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测：间隔5分钟，读数6次（共30分钟）―― 获得吸光读数
10．活性计算：4
（1） 酶标仪检测
（2） 比色皿检测
注意事项
1． 本产品为 20 次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
6． 孵育反应完成后即刻进行比色测定
7． 滤波器可以使用波长 400nm 替代 405nm
8． 测定值由低到高变化；酶动法测定可以持续 60 分钟
9． 测定值吸光读数越高，表明酶活性越高
10．比色测定后，比色皿须清洗彻底
11．待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为 50 微克/20 微升；待测样本为组织裂解悬液，其蛋白浓度为 200微克/20 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 JW30030.1）
12．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13．沉默调节蛋白 1 单位活性定义为：在 30℃，pH 8.0 条件下，每分钟内能够释放 1 微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）
与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。
订购信息5
编号 名称 规格
JW50287.2 组织沉默调节蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒 20 次
JW50287.2A 裂解液（Reagent A） 100 毫升
JW50287.2B 分离液（Reagent B） 100 毫升
JW50287.2C 清理液（Reagent C） 100 毫升
JW50287.2D 萃取液（Reagent D） 50 毫升
JW50287.2E 缓冲液（Reagent E） 50 毫升
JW50287.2F 底物液（Reagent F） 100 微升
JW50287.2G 终止液（Reagent G） 1 毫升
JW50287.2H 酶解液（Reagent H） 1 毫升
JW50287.2I 补充液（Reagent I） 1 毫升
产品编号 名称 规格
JW50287.1 细胞沉默调节蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒 20 次
JW50287.2 组织沉默调节蛋白 1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒 20 次
JW50288.1 细胞沉默调节蛋白 3（SIRT3）活性比色法定量检测试剂盒 20 次
JW50288.2 组织沉默调节蛋白 3（SIRT3）活性比色法定量检测试剂盒 20 次
JW50289.1 细胞沉默调节蛋白 1（SIRT1）活性荧光定量检测试剂盒 20 次
JW50289.2 组织沉默调节蛋白 1（SIRT1）活性荧光定量检测试剂盒 20 次
JW50290.1 细胞沉默调节蛋白 3（SIRT3）活性荧光定量检测试剂盒 20 次
