土霉素试剂盒

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物土霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争土霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物土霉素的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物土霉素的含量。

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【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹仪、刻度移液管

微量移液器：单道 20μl～200μl、单道100μl～1000μl、多道 30～300 μl

试           剂： 甲醇、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOHNaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

【实验前溶液配制】

配液1、20mM PBS缓冲液5.16gNa2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；加入蒸馏水至1000ml；用于样品提取液

的配制。

配液2、样品提取液的配制取1ml甲醇与9ml的20mMPBS缓冲液混匀。

配液3、 将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。(1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于抗体的稀释和样本提取后的复溶)。

配液4、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照 1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按 所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】

u 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具 进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u 样本处理：

（a）组织样本前处理方法（不用过柱）

1、 称取1±0.05g 均质后的样本于离心管中，加入4ml样品提取液，振荡5min，室温4000r/min 以上，离心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一试管中;加入1ml 正己烷,振荡1min，室温4000r/min 以上，离心10min；

3、 取50 μl下层液体于另一容器中，加入200μl样本稀释液混合30s；

4、 取50 μl 用于分析

    样本稀释倍数: 20 倍

（b）蜂蜜处理方法

1、 准确称取1±0.05g 蜂蜜样本于离心管中，加入4ml 样品提 取液，强烈混合振荡5min，室温 4000r/min以上，离心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一试管中，加入450μl样本稀释混合30s；

3、 取50 μl 用于分析

样本稀释倍数: 40 倍

（c）牛奶样品处理方法

脱脂牛奶

1、取出50μl 脱脂牛奶与1950μl样本稀释液，混30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、吸取1ml 牛奶样本于离心管中；于15℃环境3000r/min，离心10min；（如果没有冷冻离心机请预先冷却后再离心)

4、取出50μl 牛奶于与1950μl样本稀释液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   样本稀释倍数: 40 倍

【 酶标免疫分析程序】

u 操作步骤：

1、    将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、   按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、   编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、    加标准品/样本50μl /孔，再加入抗体工作液50μl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

5、    取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、    每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。重复步骤5。

7、    显色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

8、   测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数

        据），测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】

    结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含土霉素的含量成负相关。

1、粗略判定：

    用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含土霉素浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.892；0.1ppb为1.501；0.3ppb为1.175； 0.9ppb为0.751；2.7ppb为0.421；8.1ppb为0.198。则样品1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb；样品2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中土霉素实际浓度。           

2、定量分析：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝	B	×
	B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以土霉素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中土霉素实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

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