HR8272 线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE法)

线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE法)TMRE比罗丹明123更快地穿过质膜,并且它们的强荧光允许使用低探针浓度,从而避免聚集。由于它们的荧光对环境相对不敏感,因此TMRE的空间分辨荧光呈现其跨膜分布的无偏分布,TMRE已成功用于高分辨率对于影响活细胞中线粒体膜电位的药物的高通量筛选测定。

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线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE法)

 

产品编号：HR8272

产品组成：

储存条件：

TMRE -20℃避光保存,避免反复冻融。稀释液2-8℃保存。有效期6个月。

【注】：

● TMRE染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。

● 染色液A为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

产品简介：

线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE)是利用TMRE探针检测线粒体膜电位的试剂盒,可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化,可以用于早期的细胞凋亡检测。

线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。TMRE是一种可通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料,广泛用作检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)的荧光探针。TMRE是阳离子荧光染料,在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质。在细胞凋亡发生时,线粒体膜完整性破坏,线粒体膜通透性转运孔开放,引起线粒体跨膜电位(ΔΨm)的崩溃,TMRE重新释放出线粒体。通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化,可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。

四甲基罗丹明乙基酯(TMRE)在线粒体中的积累被证明是由它们的膜电位驱动的。此外,由于它们的疏水特性降低,这些探针对细胞表现出与罗丹明6G相比低10-20倍的电位非依赖性结合。四甲基罗丹明乙酯为动态和最佳原位定量测量荧光染料之一,比罗丹明123更好 ,因为其被活细胞快速和可逆地吸收。

TMRE比罗丹明123更快地穿过质膜,并且它们的强荧光允许使用低探针浓度,从而避免聚集。由于它们的荧光对环境相对不敏感,因此TMRE的空间分辨荧光呈现其跨膜分布的无偏分布,TMRE已成功用于高分辨率对于影响活细胞中线粒体膜电位的药物的高通量筛选测定。

TMRE可以快速通过细胞膜,仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获,并且对细胞没有毒性。TMRE的最大激发波长为549nm,最大发射波长为574nm。

检测方法：

● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦 ● 荧光酶标仪/光度计

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦 ● 离心机 ● PBS或者HBSS(不含酚红)

线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE法)使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 始终保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。

● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。

● 线粒体膜电位降低,荧光强度减弱。但是结果分析时注意排除荧光淬灭现象,TMRE荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的,其发射光有一部分(与激发光重合的部分)会被自己重新吸收,而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。换而言之,当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比,此时注意检测结果的分析。采用JC-1法可以减少荧光淬灭的影响。

使用方法：

染色工作液的配制：

根据样本数量,用37℃培养箱预热染料稀释液试剂B将TMRE荧光染料10倍稀释。再用HBSS或相应的无血清培养基或其他缓冲液将探针TMRE进行40-200倍稀释,配制成染色工作液。

【注】：

● 也可不用本试剂盒中的试剂B,直接用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释TMRE染料至所需浓度。

● 开始实验前,使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度,建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度400-2000倍稀释,1000-2000倍适合大多数细胞样本。

● 建议收到产品后,根据单次使用量,对母液进行小量分装,每次使用一管,试剂-20℃避光冻存,一年稳定。

● 工作液现配现用。

● 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性,建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

● 若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育,荧光信号会衰减。

线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE法)悬浮细胞：

1、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。

2、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

【注】：

● 300×g-500×g,2-8℃,离心时间5分钟收集细胞。

3、用500μL TMRE染色工作液将细胞重悬,细胞密度约5-10×10⁵个/mL。37℃,5% CO₂的培养箱中孵育15分钟。

4、常温离心收集细胞。用PBS洗涤细胞2次。

【注】：

● 300×g-500×g,离心时间5分钟收集细胞。

5、用 500μL预热的1×染色缓冲液将细胞重悬。

6、用流式细胞仪/荧光酶标仪/分光光度计检测分析结果,或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞：

对于贴壁细胞,可以先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。也可以直接原位染色后检测。

纯化线粒体：

1、把配制好的TMRE染色工作液再用TMRE稀释液稀释5倍。

2、0.9mL 5倍稀释的TMRE染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10～100μg的纯化的线粒体。

3、结果检测。

组织样本：

组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：

检测时可以把激发光设置为549nm,发射光设置为574nm。

线粒体膜电位降低,荧光强度减弱。

用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的情况。

也可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测。

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